1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
KHOA CNSH &CNTP

BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ KỸ - THUẬT DI TRUYỀN
Giảng viên: ThS. Dương Hữu Lộc
Sinh viên: Đỗ Thị Hào
Lớp: CNSH43
Thái Nguyên, 2013

2
Bài 1
TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ
I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
1.1 Mục đích
Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc

3
15 NaH
2
PO
4
0,16 gam
16 Sorbitol 2M 7 ml
17 Isoamyl 0,75 ml
18 Cloroform 18 ml
19 Isopropannol 100% 15 ml
20 Nước cất 1 lít
21 Nước cất đã khử ion 6 ml
Cách pha hóa chất.
1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- β - Mercapto ethanol : 250 µl
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml
- Tris HCl (pH= 8,0) : 15 ml
- H
2
O : 55 ml
- Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng ra
DNA.
- EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡ
liên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài tế bào vi
khuẩn
2) Đệm TE (Tris - EDTA) pH=8,0 gồm:
- Tris HCl (pH=8,0) :10 mM
- EDTA (pH=8,0) : 1mM

Các phương pháp tách chiết DNA thường được dùng gồm:
1. Phương pháp CTAB
2. Phương pháp PVP
3. Phương pháp phenol/chloroform
4. Phương pháp Silica
5. Phương pháp Guanidine-chloroform.
Trong phạm vi bài giảng thực hành này sẽ giới thiệu cách tách chiết DNA
tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) -
phương pháp 1. Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cải
tiến.
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là
nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn

5
hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa
chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA.
3.2. Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước)
- Bước 1: Tiến hành thu mẫu (mẫu lá), gói bằng giấy bạc để ngay vào trong nitơ
lỏng đến khi tách chiết DNA.
- Bước 2: Nghiền 0,2 - 0,3 gam lá đậu tương trong trong nitơ lỏng tành bột mịn.
- Bước 3: Chuyển bột mịn vào ống eppendof 2 ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã ủ
ở 65
0
C trong 10 phút.
- Bước 4: Ủ các ống mẫu trên ở 65
0
C trong 90 phút, trong quá trình ủ tiến hành
đảo nhẹ 20 phút/ lần.
- Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút, ở 4
0

Kết quả điện di sản phẩm tách chiết:

6

Hình 1.3. Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ đậu tương

Nhận xét:
Tách chiết DNA tổng số tương đối thành công, chấp nhận được , có DNA bị đứt
gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra
vẫn còn tạp chất như protein, bị lẫn RNA nhiều. Hầu hết các mẫu đều có DNA,
mẫu 8,9, 10 tách khá thành công, mẫu số 6 DNA không hiện có thể do trong quá
trình thao tác làm mất DNA hoặc tra mẫu điện di.
- Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, có DNA bị đứt
gãy. Lẫn tạp protein và RNA nhiều.
- Giếng số 2: Tách chiết DNA tổng số khá thành công, tuy nhiên mẫu
bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu được ít, RNA lẫn tạp khá nhiều.
- Giếng số 3: Bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu được ít hơn, có đứt
gãy.
- Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt
gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng
vir ) và RNA.
- Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, tuy nhiên lẫn
tạp protein còn dính tại miệng giếng và RNA cuối đường điện di.
- Giếng số 7 : Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, tuy nhiên lẫn
tạp protein còn dính tại miệng giếng và RNA cuối đường điện di.

7
- Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt
gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng
vir ) và RNA.

thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết
tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB.
- Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả năng tạo bọt, đồng thời
giúp tăng cường hỗ trợ khả năng kết tủa protein, hỗ trợ sự
phân pha. Sau khi bổ sung CIAA ly tâm thì có hiện tượng
phân pha ( 3 pha).
+ Pha trên : Là DNA.
+ Pha giữa: Chứa protein.
+ Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform.
- CH
3
COONa 3M pH 5.5 : ion Na
+
vào trung hòa DNA triệt
tiêu khả năng hòa tan DNA, bổ sung isopropanol sẽ kết tủa
được DNA, phân tách và thu được DNA ( CH
3
COONa,
CH
3
COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn).

8
- Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa
tủa vì DNA bị hòa tan trong nước không hòa tan trong cồn.
Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn 70%, cồn 100%
muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng
cồn xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn
cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được các phản
ứng sinh học phân tử tiếp theo.

9
Bài 2
ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng
và hàm lượng DNA. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của
axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu
tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1 Thiết bị, dụng cụ
- Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá và bể điện di, lược tạo
giếng điện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel.
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt để đun agarose
- Lò vi sóng
- Ống eppendorp loại 2 ml
- Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm bản gel
- Máy lắc
- Máy soi gen
- Máy chụp ảnh (nếu có)
2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất
- Agarose
- TAE 1X. TAE 1X được pha từ TAE 50X stock bao gồm:
+ 242 gam Tris base (FW = 121)
+ 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng)
+ 100 ml EDTA (pH = 8)
+ Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít.
Khi pha 1X sẽ cần 1 ml dung dịch 50X stock + 9 ml nước cất.

lược.
- Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE
có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể.
- Bước 4: Đặt bản gel vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt dung dịch TAE
1X, để được bản gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung dịch điện di.
- Bước 5: Lấy 10 μl ở các mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Dye 6X bằng các
ống eppendorp mới (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA được trộn đều với
Dye 6X. Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ở ống vào giếng điện di bằng micropipet.
Ghi chép lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng. Mỗi ống mẫu

11
được dùng một đầu côn hút riêng. Khi tra mẫu vào giếng, một tay tỳ lên thành
giá của điện di làm điểm dựa, tay kia đưa micropipet sao cho đầu côn vừa sát
miệng giếng rồi bơm từ micropipet ra. Cần lưu ý thao tác này nếu không cẩn
thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng.
Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút . Lúc này quan sát bằng mắt thường
có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm
sang cực dương.
- Bước 7: Lấy bản gel từ bể điện di ra nhuộm trong ethydium bromid 0,5μl/ml
trong 10 phút, thao tác nhuộm được thực hiện trên máy lắc, tốc độ chậm, chỉ
khoảng 50-70 vòng/phút. Lưu ý khi mang bản gel nhuộm cần cẩn thận vì
ethydium bromid rất độc hại với người và môi trường. Do đó, để giảm thiểu việc
tiếp xúc trực tiếp, cần dùng bằng thìa to, dạng bản, có cán dài (hình 13) để đưa
bản gel vào khay nhuộm, lấy ra khỏi khay, mang rửa lại bằng nước sạch, đến khi
đưa bản gel lên máy soi.
- Bước 8: Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi đó các axít nucleic trong gel
agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ
ethydium bromid. Chất này có khả năng xen gắn vào giữa các bazơ của axít
nucleic làm chúng phát sáng dưới dạng những vạch màu đỏ cam, dễ quan sát và
chụp ảnh.

2+
. PCR là một công cụ hữu hiệu cho
việc phân tích gen, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu
từ bất kỳ cơ thể nào.
II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1. Dụng cụ
- Lò vi sóng
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt 500 ml
- Ống PCR
- Máy ly tâm
- Máy lắc
- Máy PCR
- Bộ điện di
- Máy soi gen
2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng PCR
- Enzyme Taq polymerase
- Buffer PCR
- MgCl
2
PCR
- Nước cất đã khử ion
- Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi
“sens primer” hay “forward primer” và mồi ngược “antinsens primer” hay

14
“reverse primer”, chúng là những đoạn DNA mạch đơn ngắn (olgonucleotide) có
khả năng bắt cặp bổ sung với đầu 3’ theo chiều phiên mã của gen.
- dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP và dGTP
- Ethydium bromid

1
10x Buffer 2,5
2
25 mM MgCl2 1,5

15
3
Primer F 1,0
4
Primer R 1,0
5
100 µM dNTPs 1,5
6
5U DNA taq polymerase 0,2
7
DNA khuôn 2,0
8
H
2
O khử ion 15,3
Tổng
25

Bước 3: Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau khuếch đại một vùng trình tự gen
mục tiêu từ đậu tương sử dụng cặp mồi. Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng
PCR như sau:
- Biến tính ban đầu: 94
o
C trong 5 phút
16
IV. KẾT QUẢ Hình 2: Hình ảnh sản phẩm chạy PCR
Nhận xét:
- Phản ứng PCP thực hiện tốt, không có hiện tượng nhiễm chéo
- Xuất hiện một băng duy nhất rõ nét tại đường chạy (giếng số 5, số 6) mẫu
số 5 và 6 PCR thành công, đặc hiệu.
- Mẫu số 2, số 14 có sản phẩm PCR nhưng không đặc hiệu.
- Các mẫu còn lại không có sản phẩm. Có rất nhiều nguyên nhân ví dụ như
do không có DNA khuôn hay DNA khuôn không nguyên vẹn bị đứt gãy
nhiều, do thao tác thí nghiệm…

17
Mục lục
Bài 1: Tách chiết DNA tổng số Trang 2
Bài 2: Điện di Trang 9
Bài 3: Kĩ thuật PCR Trang 13