BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
%Ị^ %Ị^
TRẦN THI HẰNG
/ ặ ? '\ X
# / 6 J . o f 7 í ^
Mĩ HƯ^VÌỆN:;
lr ,T c f,.í'/
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BANG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NÃNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2000-2005)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
: ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh
ThS. Trần Nguyên Hà
: Bộ môn Hoá phân tích
Thời gian thực hiện : 10/2004-5/2005
HÀ NỘI 5/2005
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định
lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”,
chúng tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo và các cán bộ
bộ môn Hoá phân tích trường đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ Nguyễn Thị
Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện khoá luận này.
Tồi cũng xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trần Nguyên Hà, các thầy cô
giáo, các cán bộ trong bộ môn Hoá Phân Tích đã tạo điều kiện, thời gian, và
kinh phí giúp tôi hoàn thành khoá luận này.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô giáo, cán bộ các

2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14
2.5.1. Khảo sát và tìm điều kiện để chiết CAR từ huyết tương 14
2.5.2. Định lượng CAR trong HT bằng HPLC 16
2.53. Thẩm định phương pháp phân tích 16
2.5.4. Định lượng CAR trong HT thỏ uống viên nén Tegretol 200mg 17
Phần 3. Kết quả thực nghiệm và bàn luận 19
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CAR trong HT 19
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc kỷ 19
3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích 21
3.2. Phân tích CAR trong HT thỏ sau khi uống viên nén Tegretol 200mg 27
3.3. Bàn luận 27
Phần 4. Kết luận và đề xuất 30
4.1. Kết luận 30
4.2. Đề xuất 31
Tài liệu tham khảo 32
Phụ lục 35
Phụ lục 1. Phổ hấp thụ u v của CAR và PHE 35
Phụ lục 2. SK đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của CAR trong HT 36
Phụ lục 3. Đường chuẩn xây dựng trên nền HT trắng của thỏ 39
Phụ lục 4. SK đồ mẫu HT thỏ sau khi uống thuốc 2 giờ 39
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
AcOH : Acid acetic
CAR ; Carbamazepin.
CAR-E: Carbamazepin-10,ll-epoxid
• Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tưcmg.
: Nồng độ thuốc tối thiểu trong huyết tương.
EtOH : Ethanol.
HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao.
(High perfomance liquid chromatography)
HT : Huyết tương

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây
dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương .
- ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng được để định lượng
Carbamazepin trong huyết tương thỏ sau khi uống viên nén chứa 200mg
Carbamazepin.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Carbamazepin (CAR)
Ll.LC ôngthức[7]
C15H12N2O; M = 236,3
1.1.2. Tên khoa học [7]
5-H-dibenz [b,f] azepin 5-carboxamid
1.1.3. Tính chất 17],[14]
Bột kết tinh màu trắng. Không tan trong nước, ít tan trong cồn và aceton,
tan trong methylen clorid.
Nhiệt độ nóng chảy : 187-193° c
1.1.4. Dựơc động học [2], [15]
Thuốc hấp thu chậm qua đưcmg tiêu hoá, phân bố khắp cơ thể. Thuốc đạt
nồng độ tối đa trong máu sau 4-8 giờ. Nồng độ tối đa sau khi dùng liều
duy nhất 400 mg (viên nén) khoảng 4,5 |J,g/ml. Nồng độ tác dụng trong huyết
tương khoảng 4-12 )Lig/ml.
CAR liên kết với protein huyết tương khoảng 70-80%,
CAR chuyển hoá qua gan bằng phản ứng hydroxyl hóa và liên hợp, hoạt
chất chuyển hoá là Carbamazepin-10,11-epoxid. Thời gian bán thải khoảng từ
10-20 giờ. Thải trừ qua nước tiểu 72% và qua phân 28%, chủ yếu dưới dạng đã
chuyển hoá.
1.1.5. Tác dụng [9], [13], [15]
Thuốc có tác dụng trên động kinh cục bộ (đơn giản hoặc phức tạp) có
hoặc không kèm cơn động kinh toàn thể hóa thứ phát, cơn co cứng toàn thể và

Đinh lương nguyên liêu:
+ Phương pháp 1110], [15], [22]
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được pha trong dung môi hỗn hợp
MeOHiHj 0(1:1) và đem tiêm sắc ký riêng biệt trong cùng điều kiện.
ĐKSK: Cột CN (25 X 4,6 mm; 10 ịim)
Bước sóng: 235 nm
Lưu lượng dòng: 2 ml/phút
Tính toán hàm lượng theo phương pháp so sánh với dung dịch chuẩn.
+ Phương pháp 2 [14]
Trong cấu trúc của CAR có các dây nối đôi nên có khả năng hấp thụ bức
xạ tử ngoại. Dựa vào đặc tính này người ta định lượng CAR bằng phưcmg pháp
đo quang. Nguyên liệu CAR được hoà tan và pha loãng trong dung môi EtOH
95% và đem đo độ hấp thụ u v à bước sóng cực đại = 285 nm. Tính toán
hàm lượng theo A(l%;lcm) = 490 .
Đinh lương chế phám r 141
Chế phẩm được hòa tan bằng EtOH 95%, lọc để thu được dung dịch
trong và đem đo độ hấp thụ u v tương tự như đối với định lượng nguyên liệu
CAR. Tính toán hàm lượng so với hàm lượng CAR dựa vào A(l%;lcm).
1.2. Tổng quan về HPLC
1.2.1. Khái niệm cơ bản [5], [4]
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp ra
đời vào cuối những năm 60. Đó là một phương pháp hoá lý dùng để tách các
chất dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không
đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy
qua cột với một tốc độ nhất định, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã
được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liẽn kết hoá học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình SK xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố
hoặc rây phân tử.
+ Tuỳ thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp SK khác

So sánh thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử làm trong cùng điều
kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết to (phút) là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ (tức là chất
có tốc độ di chuyển bằng tốc độ trung bình của các phân tử dung môi khi đi
qua cột).
- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột SK:
2
N=
^ hoặc N= 16
^ hoặc N= 5,54
Trong đó:
ỏt (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
cOq 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôf
(0^: Độ rộng đáy píc
- Độ phân giải R^: Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột SK
R3= hoặc Rs=
% r \ 2 - -
® 0 ,5 .1 + < ^ 0,5 .2
Để tách riêng hai chất, Rs phải không nhỏ hofn 1,5.
- Chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng
điều kiện cho ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
1.2.4. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC[1J
Phưcmg pháp chuán ngoai:
Chuẩn hoá một điểm: Nồng độ chất phân tích được xác định bằng cách
so sánh đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) của chất đó trong dung dịch thử
và dung dịch chuẩn tiến hành phân tích ở cùng điều kiện.
Chuẩn hoá nhiều điểm: Lập mối quan hệ giữa đáp ứng y (diện tích hoặc
chiều cao pic) và lượng chất X trong dãy dung dịch chuẩn. Tính kết quả của
chất phân tích trong dung dịch thử dựa trên đồ thị của mối quan hệ giữa y và
X. Yêu cầu đáp ứng của dung dịch thử phải nằm trong khoảng đáp ứng của dãy

10 )am)
MeCN: MeOH: đệm
phosphat pH 7,0
(18: 18: 70)
MeCN
1 0 ,1 1 - dihydro
Carbamazepin
Phân tích đồng
thời CAR,
CAR-E và
phenytoin
[17]
Extrashot-
Silica™
(250 X 4,5 mm;
5 I^m)
n-hexan: AcOH: EtOH:
Dicloromethan
(82,8: 0,2: 2: 15)
Dicloromethan
Phân tích CAR
trong HT và ứng
dụng trên lâm
sàng
[19]
Zorbax SB-CN
(250 X 4,6; 5 |im)
HjOiACNiMeOH
:AcOH:'Hi
(725 : 150 : 125

RP18
(125 X 4 mm; 85
^im)
MeCN: H2O: đệm
phosphat pH 7,0
(20: 75: 5)
MeCN
butalbital
Phân tích CAR
trong HT
[9]
Lichrosorb-RP8
(250 X 4,9 mm;
1 0 |am)
MeCN: H2O
(32: 6 8 )
Dicloromethan
1 0 -methoxy
carbamazepin
Phân tích đồng
thời CAR,
oxcarbamazepin
và chất chuyển
hoá có hoạt tính.
1.4. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch
sinh học [1]
1.4.1. Khái niệm:
Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là quá
trình xác định bằng thực nghiệm những đặc điểm đặc tnmg của phương pháp
để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế.

sự phụ thuộc của tín hiệu đáp ứng (y) vói nồng độ chất phân tích (x).
- Đánh giá kết quả;
Đưòỉng hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số
tương quan (r) phải không nhỏ hơn 0,99.
1.4.4. Độ đúng:
- Định nghĩa:
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả
phân tích với giá trị thực của chất phân tích.
- Đánh giá kết quả:
Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị TB thu được so với
giá trị thực. Độ đúng có thể thay đổi từ 0% đến 100%
Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá 15% so
với giá trị thực.
1.4.5. Độ chính xác:
- Định nghĩa:
Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả
riêng biệt khi phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một
mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn hoặc độ lệch
chuẩn tương đối. Độ chính xác được chia làm hai loại:
Độ lặp lại được tính khi phép phân tích được lặp lại trong cùng một
phòng thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn và do cùng một người phân
tích.
Độ tái lặp được xác định bằng cách lặp lại phép phân tích đó ở cùng một
phòng thí nghiệm, với cùng một người phân tích nhưng trong ngày phân tích
khác.
- Các thông số tính toán:
Độ lệch chuẩn:
i
Độ lệch chuẩn tương đối:
____

- Tủ lạnh sâu (T=-50°C) Frigor (Đan Mạch)
- Máy siêu âm Bransonic-USA
- Máy lắc Labinco (Hà Lan)
- Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ)
- Máy khuấy từ Ikamag
- Autopipet 1-10 |al, 10-100 |xl, 100-1000 ụì
- Các dụng cụ thuỷ tinh và trang thiết bị khác có trong phòng thí nghiệm.
2.2. Chất chuẩn và chê phẩm thử:
- Carbamazepin: Chất đối chiếu (C = 99,0%)
- Phénobarbital: Chất đối chiếu (C = 98,7%)
- Viên nén Tegretol chứa 200mg CAR của hãng Novartis.
2.3. Hoá chất:
- MeCN và MeOH loại HPLC (Merck)
- Acid acetic băng, triethylamin, cloroform, ethylacetat, ether loại dùng cho
phân tích.
- Kali d ih y đ ro p h o s p h a t ( K H 2 P O 4 )
2.4. Súc vật thí nghiệm:
Thỏ đực khoẻ mạnh, cân nặng 2,2 - 2,7 kg, đạt tiêu chuẩn súc vật thí
nghiệm.
2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu:
2.5.1. Khảo sát và tìm điều kiện để chiết CAR từ huyết tương [20]
CAR trong HT được chiết theo sơ đồ hình 1:
Lắc xoáy 1 phút
Cloroíorm (5 ml), lắc xoáy
5 phút, li tâm 15 phút
(3500 vòng/phút), hút 4 ml
cloroíorm
Bốc hơi cách thuỷ
f < 80°c
Pha động (200 |il), lắc

- Khảo sát độ đúng của phương pháp:
Mẫu để xác định tính đúng được chuẩn bị bằng cách thêm một lượng
dung dịch chuẩn vào mẫu trắng, tối thiểu tại ba nồng độ trong khoảng nồng độ
khảo sát. Mỗi nồng độ tối thiểu năm mẫu. Xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiến
hành phân tích theo điều kiện SK ở mục 2.5.2.
- Khảo sát độ chính xác của phương pháp:
Chuẩn bị mẫu như ở phần xác định độ đúng và tiến hành phân tích. Xác
định RSD% trong hai ngày phân tích khác nhau để đánh giá độ lặp lại và độ
tái lặp của phương pháp phân tích.
- Khảo sát độ ổn định của CAR:
+ Khảo sát độ ổn định của CAR trong HT theo thời gian bảo quản:
Để theo dõi sự ổn định của chất phân tích trong HT theo thời gian bảo
quản, chúng tôi lấy 200 )Lil HT trắng, cho thêm CAR ở nồng độ 8 |a,g/ml. Mẫu
được bảo quản trong ống thuỷ tinh dung tích 10 ml, có nút xoáy và bảo quản ở
nhiệt độ -30°c. Ngay sau khi chuẩn bị mẫu và sau những khoảng thời gian 10,
20, 30 ngày, lấy mẫu ra để hết đông và thêm chất chuẩn nội với nồng độ 20
|Lig/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiến hành phân tích theo điều kiện SK ở
mục 2.5.2.
+ Khảo sát độ ổn định của CAR trong thời gian phân tích:
Mẫu HT trắng được cho thêm chất chuẩn ở nồng độ 8 |ig/ml và chất
chuẩn nội ở nồng độ 20 |Lig/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1. (Các mẫu đã xử
lý để ở điều kiện thường). Tiến hành phân tích theo điều kiện SK ồ mục 2.5.2
ngay sau khi xử lý mẫu và tại các thời điểm 1, 2, 3, 4 giờ sau đó.
2.5.4.Định lượng CAR trong mẫu HT thỏ uống viên nén Tegretol lOOmg.
+ Uống thuốc: Hai thỏ được nuôi trong vòng một tuần trước khi thử. Cho mỗi
thỏ uống Iviên nén Tegretol chứa 200 mg CAR.
+ Lấy mẫu: Khoảng 2 ml máu được lấy từ tĩnh mạch vành tai thỏ ngay trước
khi uống thuốc và sau khi uống 2, 3, 4 giờ. Mẫu được cho vào ống nghiệm có
chứa EDTA để chống đông, lắc nhẹ và ly tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong
15 phút. Tách lấy phần HT, bảo quản trong tủ lạnh sâu ở -30°c cho tới khi

ml/phút cho thấy lưu lượng dòng 0 ,8 ml/phút là tốt nhất để vừa tách riêng
được chất phân tích, chuẩn nội, vừa có thời gian phân tích hợp lý.
- Chất chuẩn nội: Định lượng CAR trong huyết tưofng đòi hỏi công đoạn xử lý
mẫu phức tạp, có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Do vậy định lượng theo
phương pháp dùng chất chuẩn nội là cần thiết.
Chất chuẩn nội được lựa chọn phải có công thức hoá học gần giống
CAR, đồng thời phải tách khỏi CAR và ổn định trong điều kiện SK. Lựa chọn
các chất đối chiếu có được, chúng tôi thấy chất chuẩn nội PHE cho kết quả
phù hợp với yêu cầu phân tích.
Từ các kết quả nghiên cứu trên đã lựa chọn được chương trình HPLC để
định lượng CAR trong HT như đã trình bày ở mục 2.5.2.
Xác định tính thích hợp của hệ thống SK:
Chuẩn bị một mẫu HT trắng, thêm CAR chuẩn ờ nồng độ 4 I^g/ml và
chất IS ở nồng độ 20 i-ig/ml. xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiêm sắc ký lặp lại
5 lần với điều kiện như đã lựa chọn được ở trên.
Xác định các thông số sau mỗi lần tiêm mẫu: Thời gian lưu của CAR
( ír c a r ) ’ tỉ lệ diện tích pic giữa CAR và chuẩn nội PHE ( R car/is) ỉ s ố đĩa lý
thuyết tính theo pic CAR ( N car) và độ phân giải giữa pic CAR và pic IS (R s ).
Kết quả thực nghiệm được trình bày theo bảng sau:
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ phù hợp của hệ thống SK
Lần tiêm
tR,CAR (phút)
^CAR/IS
Ncar
Rs
1
9,01
3,54
1073 3,01
2 9,01