BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI
ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI
ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban giám hiệu, phòng đào tạo
nhà trường và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian
ngồi trên ghế nhà trường.
Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã
động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong thời gian tôi
thực hiện đề tài này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Vũ Thị Quỳnh MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… 1
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……………………………………. 2
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin …………………………………………… 2
1.1.1.1. Tính chất ………………………………………………………………… 2
1.1.1.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 2
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3
1.1.2. Tổng quan về simvastatin …………………………………………………… 4
1.1.2.1. Tính chất ………………………………………………………………… 4
1.1.2.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 5
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin 6

2.3.4. Thẩm định phương pháp ………………………………………………… 17
2.3.4.1. Tính tương thích hệ thống ……………………………………………… 17
2.3.4.2. Tính đặc hiệu / chọn lọc …………………………………………………. 17
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ……………………………… ……… 18
2.3.4.4. Độ lặp ……………………………………………………………………. 18
2.3.4.5. Độ đúng ………………………………………………… ……………… 19
2.3.4.6. Phương pháp xử lý kết quả ………………………………………………. 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………… 21
3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ……………………… …… 21
3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 21
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ………………………………………. 21
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……………………… 22
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký ……………………………………………………… 22
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ………………………………………… 22
3.2.3. Lựa chọn pha động ………………………………………………………… 23
3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng …………………………………………… 25
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP …………………………………………… 26
3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ………………………………… …… 26 3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp …………………………….……. 28
3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ………………………………………. 28
3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……………………………………… 30
3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ……………………………………… 31
3.4. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM ………………………………………………………… 33
3.5. BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………… 37
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………. 37
ĐỀ XUẤT …………………………………………………………………… … 38

10 SĐK Số đăng kí
11 KNTTW Kiểm nghiệm thuốc trung ương
12 SKS Số kiểm soát
13 CYP3A4 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4

14 HDL High-density lipoprotein
15 LDL Low-density lipoprotein
16 dd Dung dịch
17 SIM Simvastatin
18 CA Calci atorvastatin
19 NXB Nhà xuất bản DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Ký hiệu Tên bảng Trang
1 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát pH đệm 24
2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động và tốc độ dòng 25
3 Bảng 3.3 Tính tương thích hệ thống 27
4 Bảng 3.4
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
simvastatin
29
5 Bảng 3.5
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của calci

3 Hình 3.1
Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu
simvastatin (a) và của mẫu calci atorvastatin (b)
22
4 Hình 3.2
Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm
và 246 nm
23
5 Hình 3.3
Sắc ký đồ mẫu khảo sát lựa chọn pha động với đệm
pH 4,5 của mẫu simvastatin (a) và mẫu calci
atorvastatin (b)
24
6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn kép ở pH 2,5 25
7 Hình 3.5
Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép theo chương trình chạy đã
xây dựng
26
8 Hình 3.6
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng
độ và diện tích pic của simvastatin
29
9 Hình 3.7
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng
độ và diện tích pic của calci atorvastatin
30
10 Hình 3.8
Sắc ký đồ định lượng một số chế phẩm với mẫu
chuẩn kép (a), mẫu thử của chế phẩm Simvastatin
(b) và mẫu thử của chế phẩm Atostin (c)

với hai mục tiêu cụ thể sau:
 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
 Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao

- 2 -

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin
1.1.1.1. Tính chất
a. Công thức cấu tạo [5, 23]
Calci atorvastatin là một thuốc trong nhóm statin, thuộc dẫn chất acid heptanoic
(không đóng vòng δ-lacton). Thuốc có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo calci atorvastatin
Công thức phân tử: C
66
H
68
CaF
2
N
4
O
10

Phân tử lượng: 1155,34
Tên khoa học: Calcium (β R, δ R)-2-(p-fluorophenyl)-β, δ-dihydroxy-5-

bào gan, làm giảm lượng LDL - cholesterol trong máu. Như các statin khác, calci
atorvastatin cũng làm giảm nồng độ triglyceride trong máu và hơi làm tăng lượng
HDL - cholesterol.
Dược động học: Calci atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống, với thời gian xấp
xỉ nồng độ tối đa (T
max
) 1 - 2 giờ. Sinh khả dụng tuyệt đối của thuốc là khoảng
14%, tỉ lệ gắn với protein cao (≥ 98%). Cơ chế chuyển hóa chính của calci
atorvastatin là thông qua cytochrom P450 3A4 hydroxyl để tạo thành ortho và
parahydroxylated hoạt động. Calci atorvastatin chủ yếu đào thải qua gan mật, có ít
hơn 2% thu hồi trong nước tiểu. Thời gian bán thải của thuốc là 14 giờ, hầu như
không có chu kỳ gan ruột.
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm
 Phương pháp 1 [16]:
- Cột C
18
(25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động:
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1,54 g ammonium dihydrogen orthophosphat
vào 1000 ml nước, điều chỉnh pH về 4,0 bằng acid acetic băng.
+ Dung môi A: hỗn hợp của acetonitril : tetrahydrofuran (92,5 : 7,5)
+ Pha động là hỗn hợp của dung dịch đệm pH 4,0 và dung môi A với tỉ
lệ 50 : 50
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm
 Phương pháp 2 [19]:
- Cột: cột thép không gỉ Waters Symmetry C
18
(250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
điều nhiệt cột ở 40
o


Công thức phân tử: C
25
H
38
O
5

Phân tử lượng: 418,57
Tên khoa học: Butanoic acid, 2,2-dimethyl-, 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-
dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)ethyl]-1-naphthalenyl
ester, [1S-[1α,3α,7β,8β (2S*,4S*),8aβ]]
b. Tính chất vậtlý [13, 21, 22, 23]
Simvastatin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, ít tan trong nước, tan
nhiều trong ethanol, methanol, DMSO, chloroform.
Góc quay cực:
[

]


+292
o
(C = 0,5% trong acetonitril)
Nhiệt độ nóng chảy: 135
o
C – 138
o
C
Hấp thụ UV: dung dịch trong acetonitril có các cực đại ở 231, 238, 247 nm

- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 230
nm
 Phương pháp 3 [22, 23]:
- Cột L1 4,6 mm x 25 cm, điều nhiệt cột ở 45
o
C
- Pha động: acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH 4,5 (65 : 35)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, bước sóng ghi: 238
nm
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin
 Phương pháp 1 [8]:
Phương pháp: định lượng đồng thời atorvastatin, lovastatin và simvastatin bằng
kỹ thuật sắc ký mixen điện động:
- Dung dịch điện ly nền dinatri tetraborat 15 mM pH 8,0 chứa 50 mM chất hoạt
động bề mặt sodium deoxycholat và 15% methanol
- Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu quả
48,5 cm, đường kính trong 50 µm; nhiệt độ cột 30
o
C; điện thế 30 kV. Kiểu tiêm
mẫu 50 mbar x 5 giây. Bước sóng phát hiện 237 nm
- Calci atorvastatin được dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng cho
simvastatin và lovastatin. Lovastatin dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng
calci atorvastatin

- 7 -

 Phương pháp 2 [18]:
- Định lượng atorvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin sử dụng chuẩn nội
là mevastatin:

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết
định bản chất của quá trình sắc ký. Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố,
hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng
nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố.
1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao [1, 2]
Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của
các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc
vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
 Pha tĩnh:
Sắc ký lỏng - lỏng: pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt
các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường có
đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong
sắc ký điều chế). Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha
động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng.
Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc phục
được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng. Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức
hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol. Tính phân cực
của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết
 Pha động:
Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung
môi. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ
các thành phần dung môi.
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố
thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân
cực được gọi là sắc ký pha thuận. Dung môi pha động thường là các
hydrocacbon mạch thẳng như: pentan, hexan, heptan… Trong sắc ký pha
thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm
dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử.
- 9 -

detector. Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính. Thời gian lưu của mỗi chất phụ
thuộc các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động
Trong một phép phân tích nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, nếu t
R
quá lớn thì pic
bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo
nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích
kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà t
R
phụ thuộc.
- 10 -

1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A
qua cột. Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lương giữa hai pha:
k’
A
=


.







=






=

,


,


Với quy ước K
B
>

K
A
nên α luôn lớn hơn 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 ÷ 2. Nếu α quá
lớn thời gian phân tích sẽ dài.
1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:



= 5,54




/


Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic
W
1/2
: chiểu rộng đo ở nửa chiều cao pic
1.2.4.7. Độ phân giải R
S

R
S
=
.(
,

,
)




=

R
S
=
√


×


×







Yêu cầu R
S
> 1, giá trị tối ưu R
S
= 1,5
1.2.5. Ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung, HPLC nói riêng là các kỹ thuật phân tích rất có hiệu quả để
tách và định lượng các hợp chất có cấu trúc hóa học gần như nhau trong một hỗn
hợp. Vì vậy nó được dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc
sinh vật. HPLC có các ứng dụng phổ biến sau:
1.2.5.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (t
R

C
X
: nồng độ mẫu thử
C
S
: nồng độ mẫu chuẩn
S
X
(H
X
): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
S
S
(H
S
): diện tích (chiều cao) của píc mẫu chuẩn
- Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi
tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao
(H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường
chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
 Phương pháp chuẩn nội
Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của
một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này
- 13 -

gọi là chuẩn nội. Từ dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng
độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của chất cần
phân tích trong mẫu thử.
Yêu cầu của chất chuẩn nội là:

thêm vào (∆C). Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành là nồng độ
của chất cần xác định.
- 14 -

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chế phẩm có chứa simvastatin 10mg:
- Viên nén Simvastatin 10mg (STADA - VN), SĐK: VD-7764-09, NSX: 10-
07-2012, HSD: 10-07-2014, LSX: 020712
- Viên nén bao film Winthrop (Sanofi Aventis), SĐK: VD-11615-10, NSX:
09-05-2011, HSD: 09-05-2013, LSX: 010511
Các chế phẩm có chứa calci atorvastatin 10mg:
- Viên nén Lipitad (STADA - VN), SĐK: VD-10728-10, NSX: 27-05-2012,
HSD: 27-05-2015, LSX: 030512
- Viên nén Atostin (Công ty DP Trường Thọ), SĐK: VD-9565-09, NSX: 17-
02-2012, HSD: 17-02-2015, LSX: 121
- Viên nén Hacortin (COHAVINA - XNDP150), SĐK: VD-4592-09, NSX:
30-11-2012, HSD: 30-11-2014, LSX: 28211
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
a. Hóa chất
- Acetonitril, methanol tinh khiết loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)
- Chất chuẩn: simvastatin hàm lượng 99,14% (SKS: 0210182.02) và calci
atorvastatin khan hàm lượng 98,77%, độ ẩm 4,98% (SKS: WS. 0208225) do
Viện KNTTW cung cấp
- Natriumdihydrogenphosphat dihydrat (NaH
2

- Lựa chọn điều kiện sắc ký
 Lựa chọn cột sắc ký
 Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động
 Tốc độ dòng, thể tích tiêm
 Lựa chọn bước sóng phát hiện
 Quy trình xử lý mẫu
- Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng
 Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
 Tính chọn lọc
 Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và phần trăm diện tích pic
 Độ lặp lại
 Độ đúng
 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng các chế phẩm đã chọn
- 16 -

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử
 Chuẩn bị dung môi pha mẫu
Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu
tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp.
Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích.
 Xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử
Muốn định lượng được dược chất trong chế phẩm vấn đề đầu tiên cần quan tâm
là có được quy trình xử lý mẫu hợp lý, đảm bảo dược chất được chiết tách hoàn toàn
vào mẫu thử, không bị biến đổi tính chất và không lẫn quá nhiều tạp gây sai lệch
cho kết quả phân tích.
Tham khảo các tài liệu kết hợp với thực nghiệm khảo sát lựa chọn ra quy trình
xử lý mẫu thích hợp. Tiến hành xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử.
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu
Để có thể định lượng được dược chất trong các chế phẩm, việc chuẩn bị dung