p
m
BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
* * * * * *
NGUYỄN ĐỨC HOÀNG LONG
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG VITAMIN Bj2 TRONG MỘT
SỐ CHẾ PHẨM VITAMIN SẢN x u ẤT TRONG Nước
ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THI TRƯỜNG HÀ NÔI
ỈÊ
( KHOÁ LUẬN TÓT N G p i^ Đ ^ C sĩ KHÓA 2000-2005 )
m m m
Người hướng dẫn : TÍCH
TH.S. NGUYỄN LÂM HỔNG
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH - ĐỘC CHẤT
ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Thời gian thực hiện : 2/2005 ĐẾN 5/2005
Hà Nội 5-2005
m
LỜI eĂm 0H
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến thầy TRẦN tích
TH.S NGUYỄN THỊ KlỀU ANH - TH.S NGUYỄN lầm HỒNG - những thầy
cô đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo bộ môn Hoá Phân
Tích - Độc Chất cùng toàn thể các bộ môn, Ban Giám Hiệu trường ĐH Dược
Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận.
Do thời gian hạn chế nên khoá luận không thể tránh khỏi những thiếu
sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của thầy cô, bạn bè để khoá luận của tôi
được hoàn thiện hơn.
Tôi xỉn chán thành cảm ơn.

1.3 Các chỉ tiêu đánh giá hàm lượng của vitamin 3 B- 6
1.4 Các phương pháp đã tiến hành để định lượng Vitamin B|2 7
1.4.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
7
1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

8
Phần 2: Đối tượng, phương tiện, nội dung, phương pháp
nghiên cứu

16
2.1 Đối tượng nghiên cứu -

16
2.2 Phương tiện nghiên cứu
16
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu—17
2.3.1 Cách lấy mẫu 17

3.2.4. Khảo sát độ chính xác của phưcmg pháp 23
3.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp sắc ký

24
3.3 Kết quả định lượng—

25
3.3.1. Độ đồng đều hàm lượng B|2 trong các chế phẩm thuốc viên 25
3.3.2. Định lượng Bị2 trong các chế phẩm thuốc viên

27
3.3.3. Định lượng B|2 trong chế phẩm thuốc tiêm 33
Bàn luận 34
Phần 4: Kết luận và đề xuất

35
4.1 Kết luận
35
4.2 Đề xuất
36
Tài liệu tham khảo
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CtyCP : Công Ty CỔ Phần
Cty : Công ty

đoàn thanh tra gửi về. Số lượng mẫu thuốc kiểm tra hằng năm chiếm khoảng
50% tổng số các mặt hàng thuốc đang được lưu hành trên thị trường [6].
Xuất phát từ thực tế đó, với mong muốn có một đánh giá toàn diện về
vấn đề chất lượng một số sản phẩm thuốc Vitamin 3B lưu hành tại Việt Nam
để từ đó có những đề xuất cho công tác quản lý, sản xuất tại các Doanh nghiệp
trong nước chúng tôi tiến hành thực hiện khoá luận:
"Khảo sát hàm lượng Vitamin Bị2 trong một số chề phấm Vỉtamiĩi
sản xuất trong nước đang lưu hành trên thị trường Hà Nội "
Khóa luận được thực hiện với các mục tiêu sau:
1, Lựa chọn phương pháp lấy mẫu, khảo sát các điều kiện định lượng Vitamin
Bj
2
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2 . Áp dụng các điều kiện khảo sát trên để xác định hàm lượng Vitamin B|2
trong một số chế phẩm vitamin 3B của các công ty trong nước đang lưu hành
trên thị trường Hà Nội.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 TÌNH HÌNH CHẤT LƯỢNG MỘT số THUỐC VIÊN CHỨA 3
VITAMIN Bi, Bé, Bi2 đ ang LUU hành tại v iệ t n am
1.1.1 Tình hình chất lượng một số thuốc chứa 3 Vitamin B5, B12 của
các công ty nước ngoài:
Hiện nay, trên thị trưòỉng thuốc Việt Nam, các sản phẩm vitamin 3B
nhập khẩu của các công ty nước ngoài chiếm tỷ lệ khá lớn, chủ yếu của các
hãng Dược phẩm có tên tuổi trên thế giới.
Phần lớn, trong các chế phẩm vitamin 3B của các công ty nước ngoài
đều chứa hàm lượng hoạt chất B|2 khá cao, [7, 14] , với công thức bào chế
thưòỉng là:
Thiamin hydroclorid 250mg
Pyridoxin hydroclorid 250mg
Cyanocobalamin lOOOmcg

[21].
- Thông báo số 7111/QLD-CL ngày 5/11/03 về việc thu hồi thuốc Tribf
(viên bao phim Vitamin Bị, Bg, B12) lô số 010203 của CTCP Hoá Dược Phẩm
Mekophar [22].
Điều đó chứng tỏ chất lượng thuốc sản xuất trong nước còn có nhiều
vấn đề cần quan tâm.
Hầu hết, các chế phẩm vitamin 3B sản xuất trong nước thường có hàm
lượng dược chất như sau [14]:
Thiamin mononitrat 125 mg
( hoặc thiamin hydroclorid )
Pyridoxin hydroclorid 125 mg
Cyanocobalamin 125mcg
Một số chế phẩm của các cơ sở, xí nghiệp khác lại chứa hàm lượng
Cyanocobalamin thấp hơn, như:
CTCP Dược phẩm Hà Tây viên nén Vitamin B|, B|2, Bg bao phim chỉ chứa 50
mcg B,2, hoặc Cty Dược vật tư y tế Phú Thọ viên nén Vitamin chỉ có hàm
lượng Cyanocobalamin là 10 mcg [7, 14].
Một số chế phẩm 3B thường gặp khác: Medtri - B của Qy Dược phẩm
TW Huế; TRIBF của Xí nghiệp Dược phẩm TW - 24; Triovit B của xí nghiệp
Dược phẩm TW 25; TrivitaBF của Qy CPDP - Dược liệu (Pharmedic); Vitamin
B1-B6-B12 của QyCP Dược phẩm Dược Liệu Mekong (Mekopharma);
Newcobex của Qy dược vật tư y tế Phú Thọ [7, 8,14].
1.2 TỔNG QUAN VỀ CYANOCOBALAMIN (VITAMIN B12) [1,8, 14, 28, 29,
30,31],
1.2.1 Công thức phân tử - cấu tạo
Công thức vitamin B|2 rất phức tạp, chủ yếu gồm hai thành phần chính là
nucleotit và phần cobamin, được nối với nhau qua mạch isopropanol.
MH,COC*rUCrl C'rU
MHjCOQI
-CHjCHjCOMHj

Vitamin Bị2 tham gia cấu tạo nucleprotein, DNA thymin và làm trucfng
thành hồng cầu. Ngoài ra, nó cũng giúp cho quá trình phân chia, tái tạo tế bào;
giúp cho sự trưởng thành của tế bào và bảo vệ các mô khi có nhiễm trùng,
nhiễm độc, đặc biệt đối với tế bào thần kinh.
Vitamin B|2 có tác dụng điều chỉnh một số rối loạn thần kinh
1.3 CÁC CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CỦA VITAMIN Bi2 TRONG
CHẾ PHẨM.
Trong các Dược điển, viên nén bao phim 3B không có chuyên luận
riêng, các chỉ tiêu chất lượng của viên 3B hầu hết do các nhà sản xuất tự xây
dựng nên. Dựa vào các tài liệu tham khảo và các TCCL cơ sở, chúng tôi đánh
giá hàm lượng của Vitamin B|2 trong viên 3B gồm các chỉ tiêu sau:
+ Độ đồng đều về khối lượng viên: Độ đồng đều về khối lượng viên
được qui định theo tiêu chuẩn của các Dược điển. Thường thì viên 3B có khối
lượng lớn hcfn 250 mg. Trong tổng số 20 viên đem cân, không được quá 2 viên
có khối lượng chênh lệch quá khoảng giới hạn của khối lượng trung bình và
không được có viên nào có chênh lệch gấp 2 lần độ lệch tính theo tỷ lệ. Khối
lượng viên > 250 mg thì độ lệch tính theo tỷ lệ phẩn trăm là 5% [8].
+ Độ đồng đều hàm lượng: viên nén chứa nhiều hoạt chất, trong tổng số
10 viên bất kỳ đem thử không có quá 1 viên có giá trị hàm lưcmg nằm ngoài
khoảng giới hạn 85% - 115% của hàm lượng trung bình và không có một viên
nào nằm ngoài giới hạn 75% - 125% của hàm lượng trung bình [8].
+ Địnhlượng: Tiến hành định lượng bằng phưcmg pháp HPLC với những
điều kiện đã khảo sát thì hàm lượng Vitamin Bj2 so với hàm lượng ghi trên
nhãn nằm trong khoảng giới hạn từ 90% đến 120% [23, 24].
1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÃ TIÊN HÀNH ĐỂ định LƯỢNG B,2 trong viên 3B
1.4.1 Phưong pháp quang phổ tử ngoại khả kiến [2, 4, 8]
* Nguyên tắc định lượng:
Sử dụng đặc tính hấp thụ tử ngoại của các chất để từ đó xác định chúng.
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại dựa trên định luật Lambert-Beer :
Mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng xác định tỷ lệ thuận

cột trước tiên nếu lực lưu giữ nó là nhỏ nhất, và ngược lại. Đối với mỗi chất,
sự lưu giữ được qui định bởi ba lực thành phần: Fj, F2, F3 . Trong đó, lực F|, F2
là quyết định nhất, còn lực F 3 ảnh hưởng không lớn. Lực F| là lực lưu giữ chất
phân tích trên cột, F2 là lực kéo nó ra khỏi cột. Nên với các chất khác nhau thì
các lực F|, F2 sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong
cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách hẳn nhau khi đi ra khỏi cột. Sau khi đi ra
khỏi cột, các chất sẽ được phát hiện bằng các detector và được chuyển qua bộ
phận xử lý. Kết quả sau khi được xử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị
trên màn hình. Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là
thời gian lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc đồ, và
tín hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được.
* Các đại lượng đặc trưng:
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại
và ghi thành sắc ký đồ:
Hình 13 Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2
> ÍỊị (Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm
vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, các chất khác nhau thì thời
gian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký HPLC đã chọn. Thời gian
lưu là đại lượng đặc trưng để phát hiện định tính các chất.
Trong một số phép phân tích, nếu tp, qua nhỏ thì sự tách kém, còn Ir quá
lớn (tR>20 phút) thì píc bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài. Để
thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một số yếu tố trong các yếu tố phụ
thuộc trên.
> to(Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
> t¡ị. (Thời gian lưu thực) = t^-tQ
> Wqị(Độ rộng pic ở nửa chiều cao)
> wỊ, (Độ rộng đáy pỉc)
> Độ chọn lọc a (Selectivity)
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất

Trong đó ; + Wg là chiều rộng pic ở đáy pic
+ w ị/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết
được tính bằng công thức:
N
> Độ phân giải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng đặc trưng mức độ tách khác nhau của hai chất
trên một cột sắc ký.
Công thức tính:
hoặcR
w,-nv.
w +w
Trong thực tế, nếu các pic cân đối (Gauss) thì độ phân giải tối thiểu để
2 pic tách khỏi nhau là R =1.5.
> Hệ số bất đối xứng T (Tailing factor)
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc
đồ thu được, T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa pic tại điểm — hoặc
Ậ- chiều cao pic.
20
T= —
~ 2a
Với : ^ là độ rộng pỉc đo ở — chiều cao pic
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí — chiều cao pic.
Khi T < 2,5 thì phép định lượng có thể chấp nhận được, nếu T > 2,5 thì
điểm cuối của pic rất khó xác định, cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để
làm cho pic cân xứng hơn.
* Pha tĩnh trong HPLC:
Pha tĩnh là các chất nhồi cột sắc ký, có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Đó là một yếu tố quyết định hiệu quả phân tích. Nó là chất

* Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột sắc ký. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ, hỗn hợp dung môi.
Dựa vào đặc điểm chất cần phân tích mà ta chọn hệ dung môi sao cho khả
năng tách chiết là tốt nhất. Pha động quyết định thời gian lưu của chất tan và
hiệu quả tách sắc ký.
Trong sắc ký phân bố pha thuận: Pha động phải là các dung môi hữu cơ
không phân cực hoặc ít phân cực như: n-hexan, n- heptan, cloroform
Trong sắc ký phân bố pha đảo: Pha động là hệ dung môi của những
dung môi đồng tan với nước, cũng có khi nước lại là thành phần chính của pha
động như methanol, acetonitril Trong nhiều trường hợp, thành phần pha
động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất
tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để dùng trong sắc ký
tạo cặp ion.
• Pha động thoả mãn các điều kiện sau:
+ Trơ với pha tĩnh
+ Hoà tan được chất mẫu
+ Bền vững theo thời gian
+ Có độ tinh khiết cao
+ Nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phù hợp với loại detector đã chọn
• Các yếu quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của
một hỗn hợp mẫu:
+ Bản chất của dung môi để pha pha động
+ Thành phần của các chất tạo nên pha động
+ Tốc độ của pha động
+ pH của pha động
* Phương pháp định lượng, cách đánh giá pic và cách tính kết quả trong
HPLC:
p Cách đánh giá diện tích pic

Hà Nội. Các công ty đó là: Xí nghiệp Dược phẩm TW 25, Cty Dược phẩm
TW Huế, CtyCP Dược phẩm Hà Tây, CtyCP Dược phẩm Bến Tre, Cty
Dược-vật tư y tế cửu Long, Cty Dược vật tư y tế Phú Thọ.
- Ngoài ra đối với thuốc tiêm Bj2 chúng tôi cũng mới chỉ chọn được 3
công ty có sản phẩm thuốc tiêm đang được lưu hành nhiều ở Hà Nội gồm: Xí
nghiệp Dược phẩm TW I, Xí nghiệp Dược phẩm TW 2, Cty Dược- vật tư y tế
Vĩnh Phúc.
2.2 PHƯƠNG TIỆN:
* Máy mốc - Duns cu :
- Hệ thống HPLC Merck- Hitachi
+ Bơm cao áp "Merck- Hitachi L- 6000 Pump
+ Detector u v " Merck - Hitachi L - 4000 u v detector
+ Máy tích phân " Merck - Hitachi D -2500 Chromato Intergration
+ Van tiêm mẫu Rheodyne 7125 - USA.
- Máy quang phổ Shimadzu - u v mini 1240 (USA).
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45 |am.
- Máy lắc Latineo - Hà Lan.
- Máy đo pH Jen way - Anh.
- Máy ly tâm điện Jaucin - Pháp.
- Máy siêu âm Bransonic - USA.
- Máy khuấy từ Ikamag.
- Máy lọc nước siêu sạch Elga - Anh.
- Cân phân tích Satoriuos chính xác 0,1 mg.
- Dụng cụ thuỷ tinh: pipet,ống nghịêm,cốc có mỏ,bình định mức các loại,
* Hoá chất:
- Chất đối chiếu B12: chúng tôi sử dụng chất đối chiếu là bột vitamin Bj2
nguyên chất lấy của Viện Kiểm Nghiệm.
- Methanol (HPLC).
- Na2 HPƠ4 , H3 PO4 (PA).
- Nước cất.

m^: lượng cân chất chuẩn ịmg)
m ,: lượng cân chất thử (mg)
h : hàm lượng vitamin ghi trên nhãn (mcg)
• Tiến hành định lượng vitamin Bj2 theo phương pháp của Dược điển Anh với
điều kiện sắc ký:
+ Cột Apolo C8 (150 X 4,6 mm ), 5|im
+ Dung môi động : Na2HP04 (10 %): Methanol = 63,5:36,5
+TỐC độ dòng : 1 .Oml/phút
+ Thể tích tiêm : 50|^1
+ Dung môi pha mẫu : nước cất
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến với bước sóng 361 nm
Chúng tôi định lượng lại vitamin B|2 chuẩn bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại khả kiến trước khi tiêm dung dịch này vào hệ sắc ký, thông qua việc xử
lý thống kê các kết quả khảo sát để đánh giá chương trình sắc ký đã tiến hành.
2.4 Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê nhờ phần
mềm Exel thông qua các thông số đặc trưng sau:
1 ”
Giá trị trung bình : X = —Yxị
n /=1
Độ lệch chuẩn: s =
Ì2Ì
_________
n-\
V«
Khoảng tin cậy s =
Độ lệch chuẩn tương đối RSD% = ^ 100%
Jí
n: số lần xác định
x¡: kết quả xác định lần thứ i

62.5
1.5
4 36.5
63.5 Tốt nhất
2.0
5 35.5
64.5
2.5
Qua khảo sát, chúng tôi chọn pha động là hỗn hợp dung môi gồm: dung
dịch Na2HPƠ4 10% và Methanol có tỷ lệ về thể tích là Na2HPƠ4 (10%):