BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐỀ TÀI :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ
BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO
MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TS. Trần Thanh Thúy TP. HỒ CHÍ MINH - 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC

1.2.3. Quá trình lên men lactic 16
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình 16
1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình 17
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn lactic 17
1.2.4.1. Nguồn cacbon 17
1.2.4.2. Nguồn nitơ 18
1.2.4.3. Các muối vô cơ 18
1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng 18
1.2.4.5. Oxy 19
1.2.4.6. Nhiệt độ 19
1.2.4.7. pH 20
1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20
B. Nấm men 21
1.3. Tổng quan về heo 24
1.3.1. Vị trí phân loại của heo 24
1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con 24
1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa 24
1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột 25
1.3.3. Các bệnh đƣờng ruột ở heo con 25
1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli 25
1.3.3.2. Tiêu chảy do Saimonella (Phó thƣơng hàn) 26
1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị 26
1.3.4.1. Phòng bệnh 26
1.3.4.2. Điều trị 27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. Vật liệu 29
2.1.1. Nguyên liệu 29
2.1.2. Môi trƣờng (xem Phần phụ lục) 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch [13] 29

, L
2
48
3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N
4
, L
2
48
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men 52
3.3.1. Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae 52
3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định 53
3.3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men 54
3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối các chủng nghiên
cứu 55
A. Vi khuẩn lactic 55
3.4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy 55
3.4.2. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi
khuẩn lactic 57
3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy 57
3.4.2.2. pH ban đầu 59
3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ 60
3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men 62
3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon 63
3.4.2.6. Nồng độ saccharose 64
3.4.3. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện
tối ƣu 65
B. Nấm men 66
3.5. Tạo chế phẩm probiotic 68
3.5.1. Đông khô các chủng VSV 68
3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm 68

Sinh học phân tử
TB
Tế bào
TBC
Tế bào chất
TG
Thế giới
VK
Vi khuẩn
VN
Việt Nam
VSV
Vi sinh vật
Mẫu 1.10

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ
Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm
probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.
Mã số: CS.2005.23.92
Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy Tel:0908 402 475
Email:
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM
Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :
1. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. TS. Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.
Thời gian thực hiện: 1 năm.
1. Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế
phẩm có khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả.
2. Nội dung chính:

On first study on utilization microorganisms stains to produce the preparation
probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs
Main contents:
- Isolation and selection of some acid lactic bacteria, yeast strains with high probiotic
activity.
- Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains.
- Studies the optimal conditions for their receiving biomass .
- Research on technology to produce probiotic.
- To appraise the quality of products.
- On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls.
Results obtained :
+ " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the
digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20
th
scientfic conference Ha Noi University of
Technology, 10/2006.
+ "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02,
Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006.
+ Finish 1 dissertation of Biology master, 2 dỉssertation Biology bachelors.
1

MỞ ĐẦU
Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực
phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Những năm gần đây, nhóm
VSV này đƣợc biết đến nhiều hơn với chức năng "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế
dịch bệnh cho ngƣời và vật nuôi. Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh vật sống có lợi
giúp cải thiện sự cân bằng hệ VSV tự nhiên nơi đƣờng ruột, có khả năng cạnh tranh và đối
kháng với mầm bệnh, tiết các chất trung hòa các độc tố, tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, bổ
sung các dƣỡng chất (protein, khoáng, vitamin), kích thích miễn dịch trên cơ thể ngƣời cũng
nhƣ vật nuôi.

Đề tài được thực hiện tại:
- Phòng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trƣờng ĐHSP Tp.HCM
- Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM.
- Phòng thí nghiệm CNSH và SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG
Hà Nội.
- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm tại trại chăn nuôi heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.
3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic
Khái niệm probiotic đầu tiên đƣợc mô tả nhƣ là hệ VSV trong thức ăn bổ sung cho
ngƣời và vật nuôi.
Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có
chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus" [46].
Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô
tả những VSV có khả năng kích thích sinh trƣởng của một số vật nuôi.
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trƣởng của
heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46].
Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác nhƣ Lee (Singapore),
Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều thống nhất trong định nghĩa
: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt
cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột" [41], [42],
[46].
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic
Hiện biết có khoảng gần 20 loài VK đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotic. Các VK
lactic có lợi giữ vai trò chính đƣợc sử dụng nhƣ L. acidophỉlus, Lactobacillus delbrueckii
subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve,Enterococcus
faecium ,

- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại.
- Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.
- Tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.
- Không lan truyền rộng, không gây ung thƣ và không gây bệnh.
5 Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56]

Sản phẩm, nhà sản
xuất, xuất xứ
Chủng VK lactic
sử dụng
Chức năng
Dạng sản phẩm
LC1, Nestlé (Mỹ, Pháp,
Ý, Anh, Đức)
L. bulgaricus
L. johnsonii
Kích thích hệ thống
miễn dịch
Sữa lên men
PAIGEN TWINU,
Cp-Meiji (Thái Lan)
L. bulgaricus
L. acidophilus
Tăng cƣờng sức khỏe
Sữa lên men
Lactinex, Hynson (Mỹ)
L. bulgaricus

Nội)
Endomycosis CG2
Chữa chứng tiêu chảy,
tăng chuyển hóa thức
ăn
Chế phẩm dạng bột
mịn
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic
- Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh
Khi cung cấp thƣờng xuyên các VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông
khô cho ngƣời và động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ngày), chúng sẽ
phát triển, chiếm ƣu thế và cạnh tranh với các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh
dƣỡng, về khối lƣợng các chất sinh ra bởi VSV [15], [41], [42], [46].
6

- Sản xuất các chất kháng khuẩn
Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic không chỉ là axit lactic mà còn bởi
những chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ axit hữu cơ, ethanol, H
2
O
2
, diacetyl, [11], [46], [48].
Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh axit lactic thì nhóm VK
lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác nhƣ axit acetic, axit formic, axit
propionic, Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trƣờng và khi pH đạt đến một mức
nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đƣờng ruột. Chẳng hạn nhƣ các VSV gây
thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các VSV gây
bệnh nhƣ E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium,
Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn). Một số loài nhƣ Lactococcus lactis,
Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H

cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần. Chúng có bản chất là
polipeptit hay glucoprotein. Do tính chọn lọc cao nên zymocin còn có tiềm năng chống lại
một số bệnh nan y. Theo Nguyễn Kim Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả
năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả),
trung hòa nội độc tố của E. coli, Vibrio cholerae nên đƣợc dùng trị tiêu chảy cấp tính cho
ngƣời.
- Cân bằng hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột
Đã có nhiều bằng chứng cho thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV
đƣờng ruột nhờ chế phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men. Khi cho bệnh nhân bị
chứng rối loạn dạ dày hay đƣờng ruột sử dụng L. acidophilus, B. biỷidum và B. breve sẽ làm
gia tăng số lƣợng của Lactobacillus và giảm số lƣợng của E. coli trong ruột. Bệnh nhân sử
dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi trong đƣờng ruột
8

nên ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp. và L. acidophilus để phục hồi hệ
VK đƣờng ruột cho những bệnh nhân này [46].
1.1.4. Vai trò của probiotic
a. Với con ngƣời
- Phòng và trị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm khuẩn ở dạ dày, đường ruột.
Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2
số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể,
[11], [41], [46]. Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông
khô cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và
ít nôn mửa, không tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46].
- Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa
Khi cơ thể thiếu enzym B-galactosidase, đƣờng lactose sẽ không đƣợc tiêu hóa thành
glucose và galactose và bị chuyển ngay xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi
những VK đƣờng ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi
cho việc tiêu hóa sữa. Nhƣng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lƣợng lactose sẽ giảm đi, đồng
thời enzym B-galactosidase đƣợc tăng cƣờng nhờ VK lactic sẽ có tác dụng làm giảm đi

10

lactic giúp heo con gia tăng khối lƣợng cơ thể nhƣng nó không có tác dụng trên heo trƣởng
thành [15], [42], [42], [46].
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên
heo con và heo trưởng thành [46]
Chỉ tiêu
Đối chứng
Lactobacillus
S. faecium
Axit lactic
Lƣợng chế phẩm lấy
vào
0
750mg/kg
thức ăn
1250mg/kg
thức ăn
220mg/kg
thức ăn
Heo con :
Tăng trọng trung bình
mỗi ngày (kg)

0,145 0,159
Bổ sung chế phẩm Saccharomyces cerevisiae cho heo con đang bú có khả năng làm
giảm tỷ lệ tiêu chảy 4,8%, làm tăng trọng lƣợng heo con sau cai sữa từ 2-3% so với đối chứng
và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn trong 17ngày [ll], [42], [46]. - cải thiện sự đề kháng bệnh
Khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia 2 lô thí nghiệm. Ở lô có sử dụng chế phẩm
probiotic - VBP (B. pseudolongum preparation), còn lô đối chứng không sử dụng chế phẩm.
Khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lƣợng 0,5g/ ngày, liên tục
trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần. Kết quả là hiếm thấy bệnh
tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu heo mới sinh. Trong khi đối chứng có hơn
60% mắc bệnh tiêu chảy. Hơn thế, các độc tố đƣờng ruột do các
11 VK gây bệnh sinh ra có thể đƣợc trung hòa bởi probiotic. Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và
giảm tỷ lệ chết trên heo con do tiêu chảy.
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]
Vật nuôi
Probiotic
Liều sử dụng
Ảnh hƣởng
Bò đực cai sữa
B. pseudolongum
l g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy
Heo còn bú
B. pseudolongum
0,5 g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn
Heo cai sữa

Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Sreptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết
quả số lƣợng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và heo tăng trọng nhanh.
b. Những nghiên cứu và ứng dụng ở ngoài nƣớc
Theo Lema và cộng sự (2001), để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã
trộn các VK probiotic với liều 6 x 10
6
CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho
thấy lô 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lô khác. Khác biệt này hoàn toàn
có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng probiotic.
Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hƣởng của probiotic LSP 122 đến việc
phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên
4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK B. toyoi với liều 10
6
tế bào/kg thức ăn và lô
4 sử dụng B. licheniformis với liều 10
6
và 10
7
tế bào/kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm
13

giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đối chứng (P< 0,05). Ngoài ra, tăng
trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn ở lô thí nghiệm cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó, lô
sử dụng 10
7
tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất. Theo Tuomola và cộng sự (1999),
làm thí nghiệm dùng các VK probiotic cho thấy Lactobacillus, L. johnsonii và L. rhamnosus
làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng S. typhimurium bị giảm khả năng bám
dính đến 77% bởi L. johsonii và 83% bởi L. casei.
Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm

+ Hầu hết không di động.
+ Là VSV hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí không bắt buộc.
+ Đều thuộc loại đa khuyết dƣỡng.
1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic
VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus,
Vagococcus và Bifìdobacteriwn. Những VSV đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thực
phẩm thuộc về các chi
15

nhƣ Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó Lactobacillus chiếm
vị trí quan trọng nhất [11], [14], [47], [50].
* Streptococcus
Tế bào hình cầu hay oval, đƣờng kính nhỏ hơn 2m, dạng đôi hay chuỗi ngắn hoặc
dài, ƣa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 37
0
C. Có khả năng phân giải nhiều loại đƣờng nhƣ
glucose, mantose, lactose. Chúng đóng góp vào việc tạo hƣơng vị cho sản phẩm, nhất là chất
lƣợng sữa.
* Lactobacillus
Tế bào hình que dài hoặc ngắn, thƣờng dạng chuỗi, kích thƣớc dao động trong khoảng
0.5-1.2 X 1 - 10m. Tế bào không di động; gram dƣơng; không sinh bào tử. Chúng là dạng
kỵ khí không bắt buộc, có thể tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 5
0
C- 53
0
C nhƣng nhiệt độ tăng
trƣởng tối thích từ 30
0
C - 40

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đƣờng với sự tích lũy axit lactic trong
môi trƣờng. Có thể tóm tắt theo phƣơng trình sau:
Các loài VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose. Một vài loài VK lactic lên
men đƣờng tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit
lactic còn tạo rƣợu và CO
2
, nhóm này gọi là lên men dị hình [11], [14], [47], [50].
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình
Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (Embden -
Meyerhof - Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%). Mức độ tạo thành các
sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi.
17

Phƣơng trình tóm tắt:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP + 2Pi  2CH
3
CHOHCOOH + 2ATP
glucose axit lactic
Một số VK lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis, Lactobacillus
acidophilus, L.casei, L. cremoris, L.helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, S.
thermophilus, p. cerevisiae [47], [50].

Trích đoạn Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm

---