BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
ĐỖ MINH HẠNH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ PHỤ PHẨM
SAU THU HOẠCH QUẢ VẢI
LUẬN VĂN THẠC SỸ
HÀ NỘI – NĂM 2015
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HÀ NỘI – NĂM 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được xuất
phát từ yêu cầu phát sinh trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu. Các số
liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong luận
văn được thu thập được trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa từng được ai
công bố trước đây.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả luận văn
Đỗ Minh Hạnh
Tác giả luận văn
Đỗ Minh Hạnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Yêu cầu của đề tài 2
C
hư
ơ
n
g
2.5. Phương pháp nghiên cứu 28
2.5.1. Phương pháp lấy mẫu 28
2.5.2. Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải 28
2.5.3. Đánh giá đặc tính sinh học của vi sinh vật 28
2.5.4. Phương pháp xác định sinh khối 29
2.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào, định lượng
hoạt độ enzyme 29
2.5.6. Đánh giá ảnh hưởng của pH ban đầu 30
2.5.7. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu 30
2.5.8. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến vi sinh vật 30
2.5.9. Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng VSV 30
2.5.10. Phương pháp định tên vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm 30
2.5.11. Phương pháp sản xuất chế phẩm vi sinh vật 32
2.5.12. Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm 32
2.5.13. Phương pháp xử lý số liệu 33
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1.Phân lập, tuyển chọn VSV từ các mẫu nghiên cứu 34
3.1.1. Kết quả phân tích VSV 34
3.1.2. Kết quả phân lập VSV 35
3.2. Tuyển chọn và đánh giá đặc tính sinh học 35
3.2.1. Đánh giá hoạt tính enzym ngoại bào VSV phân lập 35
3.2.2. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau 38
3.2.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh khối và hoạt tính enzym
ngoại bào của các chủng VSV 42
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại
1.3 Thành phần dinh dưỡng chính trong trái vải 12
3.1 Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu phế phẩm (CFU/g) 34
3.2 Hoạt tính enzym của các chủng VSV được chọn 36
3.3 Hoạt độ enzym xenlulaza của các chủng VSV 38
3.4 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính
enzym ngoại bào của nấm 39
3.5 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính
enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn 40
3.6 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối, hoạt tính
enzym ngoại bào của các chủng vi khuẩn 41
3.7 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào nấm 42
3.8 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối, và hoạt tính enzym ngoại bào của
xạ khuẩn 43
3.9 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào của
Vi khuẩn 44
3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh sinh khối và hoạt tính enzym ngoại
bào của VSV 45
3.11 Ảnh hưởng của các mức kháng sinh đến sinh trưởng và sinh enzym
1.1 Địa điểm thu mua vải thiều 8
1.2 Sấy vải ở Bắc Giang 10
1.3 Phụ phẩm quả vải dồn lại thành đống và bỏ đi 11
1.4 Quả vải 13
3.1 Vòng phân giải các nguồn cơ chất của 6 chủng xạ khuẩn 37
3.2 Vết thương trên căn hành và vòng đối kháng của X7 với chủng X10 54
3.3 Khuẩn lạc và hình thái khuẩn ty khí sinh, bào tử xạ khuẩn X10 55
3.4 Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA 56
3.5 Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc thù cho XK 56
3.6 Hình thái khuẩn lạc của V19, V98 trên môi trường LB 57
3.7 Chủng V19 dưới kính hiển vi điện tử 57
3.8 Cây phân loại chủng V19 dựa trên trình tự 16S rRNA 57
3.9 Chủng V98 dưới kính hiển vi điện tử 58
3.10 Cây phân loại chủng V98 dựa trên trình tự 16S rRNA 58
3.11 Sản phẩm tách chiết AND vi khuẩn V19 và V98 58
3.12 Sản phẩm PCR nhân mồi đặc thù vi khuẩn
M marker; 1: 58
3.13 Đặc điểm khuẩn lạc và cơ quan sinh sản, cây phân loại chủng N34 59
3.14 Đặc điểm khuẩn lạc và cơ quan sinh sản, cây phân loại chủng N18 60
3.15 Biểu đồ diễn biến nhiệt độ đống ủ 64
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIÊT ĐẦY ĐỦ
ADN Axit deoxyribonucleic riboxom
NXB Nhà xuất bản
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
UBND Ủy ban nhân dân
VietGAP Vietnamese Good Agricultural Practices - Thực hành
sản xuất nông nghiệp tốt ở Việt Nam
VKTS Vi khuẩn tổng số
VSV Vi sinh vật
XK Xạ khuẩn
XKTS Xạ khuẩn tổng số
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây vải (Litchi chinensis) là một trong những loại cây ăn quả á nhiệt đới, là
đặc sản của Việt Nam. Trong thành phần quả vải chứa nhiều chất có giá trị dinh
dưỡng cao như đường dễ tiêu, vitamin B, vitamin C, photpho, sắt, canxi Quả vải
ngoài ăn tươi còn được chế biến thành các sản phẩm rất phong phú như vải sấy khô,
rượu vang, đồ hộp, nước giải khát, bánh kẹo, Do vậy quả vải được nhiều người
tiêu dùng ưu tiên lựa chọn hơn so với các loại quả khác khi vào mùa quả chín.
Cây vải là cây có tính thích ứng mạnh, dễ trồng, có thể chịu được hạn nên
có thể sinh trưởng tốt trên đất đồi vì vậy nhiều tỉnh như Bắc Giang, Hải Dương,
Quảng Ninh, Phú Thọ đã và đang có kế hoạch đẩy nhanh diện tích trồng vải.
Một số tỉnh như Bắc Giang, Hải Dương đã trồng được hàng ngàn ha vải.
Vùng vải Lục Ngạn – Bắc Giang được coi là vùng vải lớn ở miền Bắc Việt
Nam. Diện tích trồng vải chiếm 74,2% diện tích trồng cây ăn quả toàn huyện. Sản
lượng quả vải trồng tại huyện Lục Ngạn thay đổi phụ thuộc vào thời tiết từng năm,
VSV.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
C
h
ư
ơ
n
g
1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về cây vải
1.1.1. Giới thiệu về cây vải
1.1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố cây vải
Cây vải còn gọi là Lệ chi (Litchi chinensis) là loài duy nhất trong
chi Litchi thuộc họ Bồ Hòn (Sapindaceae). Đây là loại cây ăn quả thân gỗ vùng
nhiệt đới, có nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc (Quảng Đông và Phúc Kiến).
Người ta thấy vải dại trong rừng 4 tỉnh phía nam (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân
Nam, đảo Hải Nam) và có nơi vải dại mọc trong rừng trên diện tích rộng. Cây vải
được di thực sang các vùng khác ở Đông Nam Á như: Việt Nam, Myanma,
Malaysia. Năm 1873, cây vải được trồng ở Hawai. Năm 1874, cây vải được trồng
rộng rãi ở Florida (Mỹ) và diện tích trồng vải được mở rộng ở nhiều nước trên thế
giới khác (Trần Thế Tục, 2003).
Theo Trần Thế Tục (1998), ở Việt Nam, cây vải được trồng cách đây
Độ là nước đứng thứ 2, chiếm 20%, Thái Lan chiếm 3,9%, Việt Nam chiếm 2,3%, các
nước còn lại sản lượng sản xuất vải chưa đến 2% (Nguyễn Phan Thiết, 2011).
Ở Trung Quốc, vải có thể được sử dụng tươi, sấy khô hoặc chế biến. Trái
vải có thể được phơi nắng cho khô hoặc sấy để lưu giữ hương vị. Hầu hết các
loại trái cây khô được bán tại địa phương và một số xuất khẩu sang các nước
khác trong khu vực.
Ấn Độ là nước có sản lượng vải thiều lớn thứ hai sau Trung Quốc, với
năng suất hơn 500.000 tấn một năm. Các giống cây trồng chính của vải thiều ở
Ấn Độ là Shahi, Calcuttia, Bedana, Late Bedana và Longia. Ấn Độ thường sử
dụng tươi, hoặc có thể được sử dụng như một loại nước ép trái cây khi đã loại
bỏ vỏ và hạt.
b) Tình hình trồng và tiêu thụ vải ở Việt Nam
Với điều kiện thuận lợi về khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có rất nhiều loại trái
cây đa dạng, có chất lượng cao phục vụ thị trường cả trong và ngoài nước.
Năm 2008, nước ta có khoảng 775.500 ha cây ăn quả, trong đó diện tích đang
thu hoạch khoảng 362.685 ha với sản lượng gần 3,9 triệu tấn/năm. Dự kiến đến năm
2020, diện tích cây ăn quả cả nước sẽ tăng lên 1,1 triệu ha, kim ngạch xuất khẩu
khoảng 1,2 tỷ USD (AgroViet, 2009).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng của một số cây ăn quả 2009 - 2012
STT
Cây ăn quả
Diện tích (nghìn ha) Sản lượng (nghìn tấn)
2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012
776,3
3 Cam, quýt 77,4
75,3
68,8
66,7
693,5
728,6
702,7
690,3
4 Nhãn 90,7
88,4
86,2
83,5
606,4
573,7
đáp ứng được các tiêu chuẩn GAP.
Gần đây, Bộ NN và PTNT yêu cầu các tỉnh căn cứ vào điều kiện và thế mạnh
của mình nên xác định từ 1 - 3 loại cây chủ lực để tập trung đầu tư, trong đó ưu tiên
chọn những loại cây có thể cạnh tranh như măng cụt, bưởi, xoài, thanh long, sầu
riêng, nhãn, chôm chôm
Một trong các loại trái cây được triển khai theo chương trình VietGAP là
cây vải. Huyện Lục Ngạn - Bắc Giang và huyện Thanh Hà – Hải Dương là 2 huyện
nổi tiếng từ trước đến nay với cây vải, đặc biệt là vải thiều. Nhờ có cây vải mà
nguồn kinh tế của hai tỉnh ngày càng khởi sắc qua các năm. Cây vải Lục Ngạn có
nguồn gốc giống cây từ cây vải Thanh Hà. Bởi giống cây này được một người dân
Thanh Hà (Hải Dương) mang lên Bắc Giang trồng và từ đó mở rộng diện tích gieo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6
trồng nơi đây. Do đó nếu xét về sản lượng thì Bắc Giang cung cấp cho thị trường
lớn hơn tỉnh Hải Dương, song xét về chất lượng vải Thanh Hà vẫn ngon, ngọt hơn
vải Lục Ngạn – Bắc Giang.
Năm 2013, toàn huyện Thanh Hà – Hải Dương có 3.975 ha diện tích trồng
vải, trong đó diện tích vải thiều là 2.965 ha, vải sớm là 1.010 ha. Đây là năm thứ
hai, huyện Thanh Hà triển khai thực hiện dự án “Xây dựng, phát triển mô hình sản
xuất vải thiều Thanh Hà đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo quy trình
VietGAP” trên diện tích 37 ha tại 361 hộ dân hai xã Thanh Sơn và Thanh Khê. Ban
chủ nhiệm Dự án đã tổ chức tập huấn kỹ thuật chăm sóc cây vải thiều, tổ chức khám
sức khỏe cho người lao động trực tiếp tham gia sản xuất, tổ chức hỗ trợ phân bón,
thuốc bảo vệ thực vật, tem nhãn, túi đựng cho các hộ tham gia dự án. Do thời tiết
cuối vụ đông liên tục có rét đậm kéo dài nên tỷ lệ vải ra hoa cao, tỷ lệ đậu quả đạt
80%, cây vải sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất của trà vải sớm ước đạt 10 – 11
tấn/ha, năng suất vải thiều ước đạt 7 – 8 tấn/ha. Tổng sản lượng vải toàn huyện ước
Bảng 1.2. Tổng hợp thông tin vải thiều tỉnh Bắc Giang năm 2013
STT
Huyện
Diện
tích
(ha)
Sản
lượng
(tấn)
Vải
sớm
(tấn)
Vải
muộn
(tấn)
Giá
bình quân
(đồng)
Giá trị
sản xuất
(Đvt: 1.000đ)
1 Lục Ngạn 17.000
72.000
6.500
65.500
7.500
500
7.000
7.000
52.500.000
5 Yên Thế 3.500
15.093
1.876
13.217
8.000
120.744.000
6 Sơn Động 1.460
4.0004.000
11.500
trong những biện pháp kỹ thuật chăm sóc vải thiều được nhân dân áp dụng thành
công, góp phần nâng cao giá trị cho quả vải là quy trình chăm sóc vải thiều theo tiêu
chuẩn VietGAP – sản xuất vải thiều sạch, an toàn. Nếu như năm 2009 vải thiều Lục
Ngạn sản xuất theo tiêu chuẩn này mới chỉ có 2.500 ha thì đến nay đã tăng lên 4.000
ha ở 20 xã, thị trấn. Thực hiện VietGAP vào chăm sóc vải thiều, người dân đã áp
dụng triệt để các quy trình kỹ thuật từ khâu bón phân, tưới nước, phòng trừ sâu
bệnh đến khâu thu hoạch đều phải bảo đảm tiêu chuẩn sạch – an toàn. Cũng nhờ vậy
chất lượng quả vải không ngừng được nâng lên: Quả to, hạt nhỏ, mã đỏ đẹp, gai
nhẵn, vỏ mỏng, ăn có vị ngọt dịu và thơm ngon hơn trước. Vải thiều Lục Ngạn đã
từng bước đáp ứng được với nhu cầu của cả các thị trường “khó tính” như ở các
nước Châu Âu, Mỹ, Nhật (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013).
Về thị trường tiêu thụ vải thiều, huyện Lục Ngạn đã cử các đoàn công tác đi
khảo sát, nghiên cứu, xúc tiến thương mại tại một số tỉnh, thành phố, địa phương
trong nước và các cửa khẩu quốc tế. Tổ chức các hội nghị khách hàng và mở 2 gian
hàng giới thiệu sản phẩm vải thiều tại thị trấn Chũ và xã Quý Sơn. Hình 1.1. Địa điểm thu mua vải thiều
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
Tiêu thụ vải thiều tươi tại thị trường lớn như Hà Nội, Huế, Đà Nẵng, TP Hồ
Chí Minh và các tỉnh phía Nam chiếm khoảng 60% sản lượng. Thị trường xuất
khẩu gồm Trung Quốc, Lào, Campuchia, (quả tươi và sấy khô), một số nước Châu
Âu (vải thiều chế biến) chiếm khoảng 40% sản lượng. Trong đó, Trung Quốc là thị
trường xuất khẩu truyền thống quan trọng, chủ yếu của vải thiều Bắc Giang, chiếm
khoảng 95% tổng sản lượng xuất khẩu, tương ứng khoảng 50.000 tấn và được xuất
tiến hành phân loại quả một lần nữa mới mang tiêu thụ được (Đức Thọ, Cổng
thông tin huyện Lục Ngạn, 2012)…
Đồng thời vụ mùa thu hoạch vải chủ yếu vào mùa hè nên phụ phẩm quả vải
bị dồn ứ sẽ nhanh chóng thối rữa, bốc mùi ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường
khu vực.
Hình 1.2. Sấy vải ở Bắc Giang
Theo Công ty xuất nhập khẩu rau - quả Bắc Giang nằm trên địa bàn xã
Phượng Sơn, huyện Lục Ngạn tỉnh Bắc Giang cho biết mỗi năm công ty chế biến
trên 200.000 tấn vải thiều tươi để đóng hộp xuất khẩu sang thị trường các nước
Châu Âu, Nhật Bản và Mỹ. Mỗi ngày công ty sản xuất cần từ 15 – 20 tấn vải tươi
do vậy phế phẩm thải ra ngoài gồm vỏ, hạt chiếm từ 40 – 60%.
Trong khi đó người nông dân tại huyện mới chỉ có một biện pháp xử lý duy
nhất đó là sau vụ vải thì gom cành, lá rồi đốt, dùng tro để bón cho cây chuẩn bị cho
vụ vải năm sau; còn các quả thối, hỏng thì đổ ra thành đống, rải rác khắp đường,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11
mương và ngay cả tại vườn vải (Đức Huy, Báo Người lao động điện tử). Hơn nữa,
theo những người nông dân thì cây vải là cây yêu cầu lượng phân bón khá lớn, đặc
biệt là phân hữu cơ từ 20 – 30kg/cây/1 đợt, trong khi để thu hoạch được quả vải là
từ 3 – 5 năm, mỗi năm có nhiều đợt bón, tùy thuộc vào thời gian sinh trưởng của
cây (Trần Thế Tục, 2002). Như vậy nếu tận dụng được lượng phế phẩm sau thu
hoạch quả vải chuyển thành phân hữu cơ bón trở lại cho đất và cây thì sẽ vừa tiết
kiệm chi phí chăm sóc cho người dân, vừa đảm bảo môi trường cho khu vực.
Hình 1.3. Phụ phẩm quả vải dồn lại thành đống và bỏ đi
1.1.2.2. Thành phần hóa học và các yếu tố tác động đến quả vải sau thu hoạch
8 Canxi mg 5,0
9 Magie mg 10,0
10 Photpho mg 31,0
11 Kali mg 171,0
12 Vitamin C mg 71,5
13 Vitamin B6 mg 0,1
(Nguồn: USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 22, 2009)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v
ă
n Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13 Hình 1.4. Quả vải
Yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến quả vải sau thu hoạch
Nhiệt độ
Thời gian thu hoạch vải chủ yếu vào tháng 6,7. Vào thời gian này nhiệt độ
trung bình cao nên tăng sự thoát hơi nước.
Ảnh hưởng của vi sinh vật
Quả vải tươi giàu về hydrat cacbon, rất nghèo protein (1%) và có pH 4,5 hoặc
thấp hơn. Do vậy, sự gây hư hỏng quả hoặc các sản phẩm về quả do vi sinh vật chỉ
giới hạn ở nấm mốc và vi khuẩn chịu axit (các vi khuẩn lactic, Acetobacter,
Gluconobactor). Quả tươi mẫn cảm với sự thối do các loại nấm mốc khác nhau từ
các chi Penicilium, Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Rhizopus và các chi khác (Lê
Văn Tán, cs.2008).
Quá trình sinh lý của quả vải sau thu hoạch (Dương Thanh Tuấn,
2012; Nguyễn Phan Thiết, 2011)
Hô hấp
Sau khi thu hoạch quả tiếp tục hô hấp để duy trì sự sống, nhưng các chất hữu
thiện. Tuy vậy, hiện nay trên thế giới phương pháp sử dụng lưu huỳnh được hạn chế
nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực thẩm.
Biến đổi hóa học
Trong quá trình bảo quản, hầu hết các thành phần hóa học của quả đều bị
Copyright: Tài liệu đại học ©