Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme
phytase

Phan Thị Thu Mai

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về axit phytic, phytate, phytase. Trình bày các phương pháp xác
định hoạt tính enzyme phytase; Tuyển chọn chủng; Phương pháp xác định khả năng
sinh trưởng; Phương pháp phân loại; Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả
năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu; Thu hồi enzyme; Nghiên cứu
enzyme phytase. Kết quả: Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA,
rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi
Bacillus; Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus
amyloliquefaciens. Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử
dụng trực tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho
động vật.

Keywords: Vi sinh vật; Chủng vi khuẩn; Sinh học; Axit

Content
MỞ ĐẦU
Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật,
phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong các cơ thể sống.
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của phospho trong tự
nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu và hạt lấy dầu (axit phytic
chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho
người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các

điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công
nghiệp giấy và cải tạo đất trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là
mối quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn về địa
hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu
cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài
nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài
vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu
trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm.
Những đóng góp của đề tài
- Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và
ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus.
- Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus
amyloliquefaciens.
- Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực tiếp trong
thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động vật. 3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ, không
phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà
nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng ―globoid‖ (dạng cầu) và khẳng định thành phần hóa
học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm 1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-
phosphoic và sau đó năm 1968 được duyệt lại là ‗myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis
(dihydrogen) phosphate (IP
6
) bởi IUPAC-IUB. Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại
thực vật khác nhau, chúng chiếm đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa

Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay
phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26),
dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate đầu tiên của vòng inositol. Dựa trên pH hoạt động tối ưu,
phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính. Ngoài ra, dựa vào cấu
hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là:
histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple axit
phosphatase (PAP) phytase.

4
Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau
tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công
nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh. Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều
trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase.
1.3 LÊN MEN XỐP
Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật trên cơ chất
không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ cơ học (giá thể) và
vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Với đặc điểm độ ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp
với một lượng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn.
Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá
trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất
độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất
thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có
giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt
động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt
tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm. 1.4 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS
Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành
Firmicutes, có khả năng sinh nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay

t . Phytase của các chủng thuộc loài
Bacillus amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao
với Ca
2+
. Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng
lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự
có mặt của Ca
2+
cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này.
1.5 THU HỒI ENZYME
Trong quá trình sản xuất enzyme bằng lên men chìm hay lên men pha rắn sinh ra hàng
trăm loại enzyme khác nhau, đặc biệt là lên men pha rắn lượng tạp chất trong enzyme còn lớn
hơn rất nhiều và enzyme gắn bám vào các cơ chất xốp gây khó khăn cho việc nghiên cứu.
Quá trình thu hồi enzyme nhằm chiết rút được những enzyme nhất định, giữ lại được tối đa
hoạt tính enzyme và loại bỏ các hợp chất không tan, cô đặc enzyme nhằm phục vụ cho quá
trình tinh sạch enzyme hoặc sản xuất các chế phẩm enzyme. Đặc tính tự nhiên của enzyme,
nguồn gốc enzyme (từ nấm sợi hay vi khuẩn) và loại cơ chất sử dụng là 3 yếu tố chính ban
đầu đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất enzyme từ cơ chất rắn (cách lựa chọn dung
dịch chiết và phương pháp chiết rút), ngoài ra quá trình chiết xuất thu hồi enzyme trong lên
men xốp còn phụ thuộc vào yếu tố như thời gian ngâm chiết, dung dịch chiết, nhiệt độ ngâm
chiết và tốc độ khuấy.

2
O- 0,5; FeSO
4
- 0,01; MnSO
4
- 0,01; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần
100
o
C 15 phút.
- Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): Glucose-
10; Na-phytate- 4; CaCl
2
- 2; NH
4
NO
3
- 5; KCl- 0,5; MgSO
4
.7H
2
O- 0,5; FeSO
4
- 0,01; MnSO
4
-
0,01; agar- 16, khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100
o
C/15 phút.
- Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase: các môi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật
sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có công thức lần lượt:

o
C/15 phút.
+ Môi trường G (g/l): bột đậu tương- 5; sucrose-1; Asparagin-0,5; KCl-0,5; FeSO
4
- 0,01;
MnSO
4
- 0,01; pH 5, khử trùng 121
o
C/15 phút.

7
+ Môi trường J (g/l): Glucose-10; CaCl
2
- 2; NH
4
NO
3
- 5; KCl- 0,5; MgSO
4
.7H
2
O- 0,5; FeSO
4
-
0,01; MnSO
4
- 0,01; Na-phytate- 0,2%; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100
o
C/15

+ Sàng lọc các chủng có sinh tổng hợp phytase
Định tính: Cấy zic zắc các chủng vi khuẩn ưa nhiệt lên môi trường sàng lọc phytase (môi
trường PSM) và nuôi ở tủ ấm 37
o
C trong 5 ngày, sau khi các khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành
lấy các khuẩn lạc xuất hiện vòng trong xung quanh. Đây là các khuẩn lạc vi khuẩn sinh
enzyme phân giải Na-phytate.
Định lượng:
+ Chủng nghiên cứu được nuôi lắc trong các môi trường dịch thể có bổ sung Na-phytate kích
thích sinh phytase là G, H, J, K1, K2 ở 40
o
C, 200 vòng/phút, sau 3 ngày dịch nuôi cấy được ly
tâm loại bỏ sinh khối và phần dịch trong được dùng để xác định hoạt tính phytase
+ Tiến hành nuôi xốp các chủng vi khuẩn có sinh enzyme phytase trên môi trường gạo lức +
dung dịch làm ẩm, sau đó tách chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme để lựa chọn
chủng có hoạt độ phytase cao nhất.
- Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng: khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
được xác định bằng số lượng tế bào trên ml(g).
+ Phương pháp phân loại dựa vào đọc trình tự ADN r16S và 5 gen chức năng gyrA, rpoB,
purH, polC, groEL.

8
- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên
cứu: lựa chọn môi trường nuôi cấy, lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy, pH thích hợp, lựa chọn thời
gian nuôi cấy, lựa chọn chế độ thông khí
- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp phytase ở chủng
nghiên cứu: lựa chọn cơ chất, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn độ ẩm, lựa chọn tỷ lệ cấy
giống, lựa chọn nguồn cacbon bổ sung, lựa chọn nguồn nitơ bổ sung, lựa chọn các ion kim
loại bổ sung, ảnh hưởng của Ca
2+

Hìn
h 1.
Sinh
trƣởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM
Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men
dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày
xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau
3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase.
Bảng 1. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên
men xốp
Chủng
Hoạt tính phytase
Môi trường lên men dịch thể
(U/ml)
Môi trường lên
men xốp (U/g)
G
H
J
K1
K2
SP1901
0
0
0,63
0,35
0,26
Bảng 2. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60
o
C
STT
Chủng
Nhiệt độ
Thời gian xử lý (phút)
Hoạt độ tƣơng đối (%)
1
SP1901
60
o
C
Đối chứng (0)
100
10
95,3
20
93,95
30
90
2
D15
60
o
C
Đối chứng (0)
100

100
Bacillus isabeliae_AM503357
100
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
Bacillus altitudinis_AJ831842
100
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
100
99
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus sonorensis_AF302118
89
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus malacitensis_AY603656
69
Bacillus subtilis_AB042061
54
Bacillus vallismortis_AB021198
66
SP 1901
Bacillus methylotrophicus_EU194897
Bacillus amyloliquefaciens_NR041455
77
Bacillus nematotocita_AY820954
65

Hình 4. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901
Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus pumilus NRRL NRS-272
Bacillus sonorensis NRRL-B-23154
Bacillus licheniformis DMS 13
SP
1901
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42
Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7
100
Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213
Bacillus mojavensis NRRL B-14698
Bacillus vallismortis NRRL B-14890
Bacillus tequilensis NRRL B-41771
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052
Bacillus subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744
96
80
73
100
100
100
98
100
100
100
0.02

13
Hình 11. Độ ẩm thích hợp cho lên men
xốp của chủng SP1901
Hình 12. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho
lên men xốp của chủng SP1901

Hình 13. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của
chủng SP1901

15 Hình 14. Nguồn các bon thích hợp cho lên
men xốp của chủng SP1901
Hình 15. Nguồn nitơ thích hợp cho lên
men xốp của chủng SP1901
Hình 16. Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến
khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng
SP1901
Hình 17. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng
Ca
2+
đến khả năng sinh tổng hợp
phytase của chủng SP1901
Với những kết quả thu được khi tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp của chủng
SP1901, ngô vỡ là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình sản xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ

SO
4
, hoạt tính phytase
mất hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn. Do đó không thể sử dụng muối (NH
4
)
2
SO
4
khi tủa
phytase trong trường hợp này. Khi tủa bằng cồn và acetone (hình 19) phytase tủa nhiều nhất ở
nồng độ cồn và acetone 70%.
3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901
3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi
Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các
chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank. Cây phân loại được
xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm
Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.
Kết quả ở hình 20 cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen
phytase của chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42, 97% với trình tự gen phytase của
chủng Bacillus sp. B13, 96% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus sp. DS11, 90% với
trình tự gen phytase của Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Trong cây phát sinh được xây
dựng dựa trên trình tự gen phytase, các loài Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus subtilis
nằm xen kẽ lẫn nhau. Khi so sánh vị trí của chủng SP1901 trong 2 cây phát sinh chủng loại

17
được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase và 6 gen cho thấy: trong cây xây dựng dựa trên 6
gen, vị trí của chủng SP1901 rất gần với 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens DSM7 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, tuy nhiên
trong cây dựa trên trình tự gen phytase, vị trí chủng SP1901 chỉ gần với Bacillus

Bacillus sp. SDBZ4_GU198969
Bacillus subtilis_AF298179
Bacillus subtilis B9601-Y2 _EU624118
Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220
B.amyloliquefaciens subsp plantarum YAU B9601-Y2_HE774679
Bacillus amyloliquefaciens Y2_CP00333
Bacillus subtilis WHNB02_AY220075
Bacillus sp. SD01N_AY518208
48
74
64
61
62
82
98
68
57
Bacillus amyloliquefaciens LL3_CP002634
Bacillus amyloliquefaciens TA208_CP002627
Bacillus amyloliquefaciens XH7_CP002927
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163
92
Bacillus amyloliquefaciens_AF453255
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644
Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773
Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256
100
Bacillus subtilis McCoyRa_JN886002

trong 24h
Hình 23. pH hoạt động thích hợp của
phytase chủng SP1901
Hình 24. Nhiệt độ hoạt động thích hợp
của phytase chủng SP1901 19 Hình 25. Ảnh hƣởng của các ion kim loại
đến hoạt tính của phytase chủng SP1901
Hình 26. Ảnh hƣởng của enzyme
tiêu hóa đến hoạt động của phytase
chủng SP1901

Hình 27. Ảnh hƣởng của Ca
2+
đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60
o
C
(phải), xử lý ở 70
o
C (trái)
Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho
thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60
o

o
C hoạt tính phytase chỉ còn 31%. Phytase của chủng SP1901 bền với

20
enzyme tiêu hóa trypsinee 0,1mg/ml pH 8 khi được ủ với trypsinee trong 30 phút và bị giảm
dần hoạt tính khi tăng dần thời gian ủ với pepsine 10 mg/ml pH 3.

KẾT LUẬN
- Từ 346 chủng, đã sàng lọc được 91 chủng chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng được ở
40
o
C. Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể,
lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase
cao và bền nhiệt.
- Chủng SP1901 được định danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum dựa trên

2+
và Cu
2+
làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế
hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca
2+
làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60
o
C và 70
o
C. Khả
năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn
cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsine.

References
TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi
khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2. Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong
Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi. Luận án tiến sĩ, Đại học sư
phạm Hà Nôi.
3. Nguyễn Thùy Châu (2009), Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo dự án khoa học
kỹ thuật - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công
nghệ sau thu hoạch.

TIẾNG ANH
4. Anderson RJ (1914), A contribution to the chemistry of phytin. I. Composition of
barium phytate and phytic acid. II. A study of the properties of phytic acid and its

proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome
sequence comparisons. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology 61(8): 1786-1801.
14. Bourdillon J (1951), A crystalline bean seed protein in combination with phytic acid.
Journal Biological Chemistry 189(1): 65-72.
15. Byrd CA, Matrone G (1965), Investigations of chemical basis of zinc-calcium-phytate
interaction in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology
and Medicine 119: 347-349.
16. Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011), Bacillus amyloliquefaciens G1: A
Potential Antagonistic Bacterium against Eel-Pathogenic Aeromonas hydrophila. Evid
Based Complement Alternat Med 2011: 7.
17. Caldwell AG, Black CA (1958), Inositol hexaphosphate. III. Content in soils. Soil
Science Society of America Journal 22: 290-293.
18. Cheryan M (1980), Phytic acid interaction in food systems. CRC critical reviews in food
science and nutrition 13: 297-335.
19. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I,
Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J,
Süssmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R. (2007), Comparative
analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium
Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnol 25(9): 1007-1014.
20. Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001), Purification and properties of extracellular phytase
from Bacillus sp KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20(4): 287-292.
21. Chun J & Bae KS (2000), Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa
based on partial gyrA gene sequences. Antonie Van Leeuwenhoek 78(2): 123-127.
22. Cosgrove DJ, Irving GCJ, editors (1980), Inositol Phosphates: Their chemistry,
Biochemistry and Physiology. North Holland, Inc., New York: Elsevie: 191.
23. Davies NT, Nightingale R (1975), The effects of phytate on intestinal absorption and
secretion of zinc,and whole body retention of zinc, copper, iron, and manganese in rats.
Bristish Journal of Nutriton 34(2): 243-258.

35. Greiner R, Konietzny U (2006), Phytase for food application. Food Technology and
Biotechnology 44: 125-140.
36. Greiner E, Konietzny U (1996), Construction of a bioreactor to produce special
breakdown products of phytate. Journal Biotechnology 48(1-2): 153-159.
37. Gulati H. K., Chadha B. S., Saini H. S. (2007), Production and characterization of
thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolacticus isolated from rhizosphere soil.
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34(1): 91–98.
38. Gupta R, Beg QK & Lorenz P (2002), Bacterial alkaline proteases: molecular
approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology 59(1):
15-32.
39. Gupta SK, Venkatasubramanian TA (1975), Production of aflatoxyn on soybeans.
Applied Microbiology 29(6): 834-836.
40. Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh BH. (2000), Crystal
structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states.
Nature Structural & Molecular Biology 7(2): 147-153.
41. Harland BF, Morris ER (1995), Phytin: A good or a bad food component. Nutrition
Research 15: 733-754.
42. Harland BF, Oberleas D (1987), Phytate in Foods. World Review of Nutrition &
Dietetics 52: 235-259.

24
43. Hartig T (1855), Über das Klebermehl. Bot Ztg 13: 881-882.
44. Hartig T (1856), Weitere mittheilungen das klebermehl (Aleuron) betreffend. Bot Ztg
14: 257-268.
45. Hawkins PT, Poyner DR, Jackson TR, Letcher AJ, Lander DA, Irvine RF (1993),
Inhibition of ironcatalysed hydroxyl radical formation by inositol polyphosphates: a
possible physiological function for myo-inositol hexakisphosphate. Biochemical Journal
294(3): 929-934.
46. Honke J, Kozlowska H, Vidal-Valverde C, Frias J, Gorecki R (1998), Changes in
quantities of inositol phosphates during maturation and germination of legume seeds. Z

protein Digestibility. Journal of Food Science 50(4) : 1080–1082.
59. Konietzny U, Greiner R, editors (2003), Phytic acid and nutritional impact. 2 ed.
Amsterdam: Elsevier Science: 4546-4563.

25
60. Kostrewa D, Wyss M, D'Arcy A, van Loon APGM (1999), Crystal structure of
Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase at 2.4 A resolution. Journal Molecular
Biology 288(5): 965-974.
61. Koumoutsi A, Chen XH, Vater J & Borriss R (2007), DegU and YczE positively
regulate the synthesis of bacillomycin D by Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42.
Applied Environmental Microbiology 73(21): 6953-6964.
62. Kubo Y, Rooney AP, Tsukakoshi Y, Nakagawa R, Hasegawa H & Kimura K (2011),
Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to natto (fermented soybean)
production. Applied and Environmental Microbiology 77(18): 6463-6469.
63. Lei XG, Ku PK, Miller ER, Yokoyama MY (1993), Supplementing corn-soybean meal
diets with microbial phytase linearly improveshytate phosphous utilization by weanling
pigs. Journal Animal Science 71: 3359-3367.
64. Lei XG, Porres JM (2003), Phytase enzymology, applications, and biotechnology.
Biotechnology Letters 25(21): 1787-1794.
65. Lei Xin Gen, Porres Jesus M., Edward J. Mullaney and Henrik, Brinch-Pedersen,
Phytase: Source, structure and application. Industrial Enzymes: 505–529.
66. Lott JA, Ockenden I, Raboy V, Batten GD (2002), A global estimate of phytic acid and
phosphous in crop grains, seeds, and fruits. In: Reddy NR, Sathe SK, editors. Food
Phytates. Boca Raton, FL: CRC Press: 6-23.
67. Lott JNA, Buttrose MS (1978), Globoids in protein bodies of legume seed cotyledons.
Australian Journal of Plant Physiology 5: 89-111.
68. Lönnerdal B (2000), Dietary factors influencing zinc absorption. Journal Nutrition 130:
1378-1383.
69. Maddaiah VT, Kurnick AA, Riel BL (1964), Phytic acid study. Proceedings of the
Society for Experimental Biology and Medicine 115: 391-393.