ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH
ENZYME PHYTASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***************

1.1.1 Cấu trúc của axit phytic 14
1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate 15
1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic 17
1.1.4 Ảnh hưởng của phytic tới môi trường 21
1.2 PHYTASE 21
1.2.1 Chức năng của phytase 21
1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase 22
1.2.3 Nguồn phytase trong tự nhiên 23
1.2.4 Phân loại phytase 24
1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP) 25
1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys) 26
1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases 27
1.2.5 Gen mã hóa phytase 27
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật 29
1.2.6.1 Các yêu tố vật lý 29
1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 30
1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase 31
1.2.8 Các ứng dụng của phytase 33
1.2.8.1 Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản… 33
1.2.8.2 Ứng dụng của phytase trong công nghiệp thực phẩm 35
1.2.8.3 Ứng dụng của phytase trong cải tạo đất 36
1.2.8.4 Ứng dụng của phytase trong dược phẩm 36
1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase 37
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE 37
1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt của phytase 37
1.3.2 Nghiên cứu về thay đổi pH hoạt động tối ưu của phytase 38
1.3.3 Nghiên cứu về khả năng bền axit và enzyme protease của phytase 39
1.3.4 Nghiên cứu về tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase 40
1.3.5 Nghiên cứu về động vật và thực vật chuyển gen phytase 41

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 59
2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 59
2.2.2 Tuyển chọn chủng 61
2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 61
2.2.4 Phương pháp phân loại 61
2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 61
2.2.4.2 Quan sát hình thái 65
2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase
của chủng vi sinh vật nghiên cứu 66
2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh
trưởng ở chủng nghiên cứu 66
2.2.5.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng
tổng hợp phytase ở chủng nghiên cứu 67
2.2.6 Thu hồi enzyme 68
2.2.6.1 Chiết xuất enzyme 68
2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 68
2.2.7 Nghiên cứu enzyme phytase 69
2.2.7.1 Gen mã hóa phytase 69
2.2.7.2 Các đặc tính của enzyme 70
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72
3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 72
3.1.1 Lựa chọn chủng ưa nhiệt 72
3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao 72
3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt 73
3.2 PHÂN LOẠI 74
3.2.1 Xác định trình tự ADNr 16S 74
3.2.2 Đặc điểm hình thái 77
3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 78
3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 78
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 81

Trang
Bảng 1. Hàm lượng phosphor và phytate ở một số loại thức ăn gia cầm phổ biến
6
Bảng 2. Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……………………………….
47
Bảng 3. Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại 5 gen gyrA, rpoB, purH,
polC, groEL…………………………………………………………………………
53
Bảng 4. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S…………………
54
Bảng 5. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên men xốp và lên
men dịch thể
63
Bảng 6. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60
o
C…………………………
64

Tên hình
Trang
Hình 1. Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và Anderson,
1914 (B)………………………………………………………………………………….
5
Hình 2. Sự tương tác của các ion kim loại với IP
6
………………………………………
8
Hình 3. Sự liên kết của IP
6
với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)…….

70
Hình 17. Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………
70
Hình 18. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………
71
Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………
72
Hình 20. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp của chủng SP1901…………
72
Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
74
Hình 22. Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng
âm: không bổ sung nguồn các bon)……………………………………………………
75
Hình 23. Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng âm:
không bổ sung nguồn nitơ)………………………………………………………………
75
Hình 24. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
76
Hình 25. Ảnh hưởng của hàm lượng Ca
2+
đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
77
Hình 26. Chiết xuất enzyme bằng các dung môi khác nhau…………………………….
78
Hình 27. Tủa enzyme bằng cồn và aceton……………………………………………….
80

EDTA Ethylene diamine tetracetic acid
GRAS Generally regarded as safe
GIT Gastro intestinal tract- ống dạ dày ruột
HAP Histidine acid phosphatase phytase
IP1, IP2, IP3,IP4,IP5 Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate
IP
6
Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate
IUB International Union of Biochemistry
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
NCBI National Center for Biomedical Informatics
PAP Purple acid phosphatase phytase
PDB Protein database bank
Pi Phosphate vô cơ
Tm Nhiệt độ biến tính
ppm Một phần triệu

MỞ ĐẦU
Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
sinh vật, phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong
các cơ thể sống. Ở các cơ thể sống, phospho vô cơ dưới dạng phốtphat PO
4
3-
tham

vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động
vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong
đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta
thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ
thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, bổ
sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn
gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm tăng
chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là
thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có
trong thức ăn, giải phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh
dưỡng và khoáng khác. Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn
được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol
phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất
trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là mối quan tâm
của nhiều nhà khoa học.
Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập
khẩu theo Quyết định số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008. Chính vì vậy, những
nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang
được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm. Chúng ta đã biết đến phytase từ
Aspergillus niger với rất nhiều ưu điểm như: bền nhiệt, khả năng hoạt động ở pH
axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ tiêu hóa
của vật nuôi. Tuy nhiên việc tìm kiếm các loài vi sinh vật khác có khả năng sinh
enzyme phytase cũng là một việc rất cần thiết.
Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn
về địa hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật,
cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh
enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp chế biến

phospho tổng số trong các loại hạt tồn tại dưới dạng phytate, đây là dạng dự trữ
chính của phospho trong ngũ cốc, hạt đậu và các mô thực vật khác [111].
1.1.1 Cấu trúc của axit phytic
Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ,
không phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật [43, 44]. Sau Hartig,
cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng “globoid” (dạng cầu)
và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm
1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-phosphoic và sau đó năm 1968 được
duyệt lại là ‘myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis (dihydrogen) phosphate (IP
6
) bởi
IUPAC-IUB [44, 110].
Cấu trúc của phytic axit là đối tượng tranh cãi của ngành hóa học trong nhiều
năm ở thế kỷ 20 và cuối cùng 2 cấu trúc do Neuberg và Anderson đề xuất được
chấp thuận nhiều nhất [87, 88]. Nhiều ý kiến khác nhau cho rằng chúng là dạng
đồng hình và có hay không 3 phân tử nước gắn kết trong cấu trúc này, thì sau đó với
những phân tích về nguyên tử, chuẩn độ natri phytate với các ion kim loại, tinh thể
học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đã dẫn đến kết luận rằng cấu trúc do Anderson
đề xuất là dạng chiếm ưu thế hơn được tìm thấy trong các loài thực vật [43].
Thành phần
P tổng số (%)
P dạng phytate (%)
Ngũ cốc
Ngô
0,39
0,25
Gạo
0,15
0,09
Lúa mỳ
0,44
0,27
Lúa miến
0,3
0,22
Đại mạch
0,33
0,2
Bajra
0,31
0,23
Hạt chứa dầu
Lạc
0,6
0,46
Đỗ tương
0,88
0,56
Hạt bông

trong quá trình phosphoyl hóa như IP
5
, IP
4
, IP
3
, IP
2
và cả IP
6
cũng tham
gia vào quá trình truyền tín hiệu tế bào và hệ thống vận chuyển phosphate có mặt ở
hầu hết các mô động và thực vật [79]. Ở thực vật quá trình tổng hợp IP
6
diễn ra
thường xuyên tuy nhiên đã có những bằng chứng chứng minh rằng ở người đôi khi
có sự tổng hợp IP
6
từ D-glucose nhờ hoạt động của enzyme phosphoylase đối với
inositol-phosphate từ sự đóng vòng của glucose-6- phosphate. Một số loại mô của
động vật có vú như tinh hoàn, tuyến vú, não, gan, thận có thể tổng hợp 4g IP
6
mỗi
ngày [41, 112].
1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic
IP
6
là một cấu trúc tích điện âm ở dải pH rộng nên dễ dàng kết hợp với các ion
tích điện dương như các ion kim loại, các hợp chất tích điện âm hình thành các phức
khó tan làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất này trong ruột non. Do đó

2+
> Mn
2+
> Fe
2+
> Ca
2+
[69, 150]. Các ion kim loại có thể
tương tác với các nhóm OH
-
của cùng một nhóm phosphate hoặc các nhóm
phosphate khác nhau trong phân tử IP
6
, thậm chí ion kim loại có thể liên kết với các
nhóm phosphate của các phân tử IP
6
khác nhau. Sự không hòa tan của các phức này
cũng là nguyên nhân chính gây ra giảm khả năng hấp thu các ion kim loại trong các
khẩu phần ăn có chứa hàm lượng axit phytic cao. Ngoài ra, sự có mặt đồng thời của
2 ion kim loại khác nhau làm tăng quá trình kết tủa của các phức IP
6
-kim loại [126].
Sự ảnh hưởng của IP
6
tới khả năng hấp thụ các ion kim loại này còn phụ thuộc vào
các yếu tố khác như cách thức chế biến thức ăn, các loại IP
6
khác nhau, sự có mặt
của các yếu tố khác cũng có tương tác với ion kim loại (yếu tố cạnh tranh với IP
6

với các phức IP
6
-Zn tương ứng nên sự hình thành của phức IP
6
-Ca-Zn thậm chí còn
kích thích các triệu chứng của sự thiếu hụt kẽm [15,138]. Ngoài ra khi bổ sung natri
phytate vào bánh mỳ trắng hoặc sữa cũng làm giảm sự hấp thụ sắt ở người xuống 15
lần [127]. Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phytate không có ảnh hưởng tới sự
hấp thu sắt ở động vật mặc dù protein đậu nành (có chứa hàm lượng lớn phytate)
được cho là nguồn thức ăn giàu sắt [131]. Sau này những nghiên cứu của các nhà
khoa học đã tìm ra rằng dạng tồn tại chính của sắt ở trong cám lúa mỳ và đậu nành
là dạng mono, có khả năng sử dụng được trực tiếp cao, tương tự như khẩu phần ăn
có bổ sung sắt vô cơ hoặc ammoni sulfate sắt [82]. Sự bổ sung 1% phytate vào chế
độ ăn có albumin trứng làm giảm đáng kể khả năng hấp thụ đồng và mangan ở
chuột [24].
IP
6
là một cấu trúc tích điện âm nên IP
6
còn có khả năng tương tác trực tiếp
với các nhóm tích điện dương hoặc gián tiếp với các nhóm tích điện âm của các
protein tích điện dương có mặt trong thức ăn thông qua các ion kim loại tích điện
dương như Ca
2+
để hình thành nên các phức IP
6
- protein tích tụ lại và kết tủa xuống,
do đó làm giảm khả năng tiếp xúc với protease, dẫn đến giảm hiệu quả tiêu hóa
protein [14, 18, 58, 111, 130, 138, 146]. Bên cạnh đó, tính tan kém của protein còn
do bị axit phytic bao phủ điện tích dương làm thay đổi điểm đẳng điện của protein

và vẫn cần rất nhiều các nghiên cứu invivo.
(A) (B)
Hình 3. Liên kết của IP
6
với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)
Bằng cách liên kết với các ion kim loại, protein IP
6
gián tiếp làm suy giảm
hoạt tính của một số các enzyme như protease, các enzyme tiêu hóa khác mà cần
các ion kim loại cho sự hoạt động cũng như tính bền vững của chúng. Một số các
metalloenzyme như cacboxypeptidase, leucine aminopeptidase, amylase,
phosphates kiềm và aminopeptidase chứa kẽm hoặc canxi có mặt một lượng nhỏ
trong ruột và cần thiết cho quá trình phân giải thức ăn. Phức IP
6
-Cu có thể làm giảm
tới 95% hoạt tính của cacboxypeptidase A do thay thể Cu
2+
bằng Zn
2+
trong phân tử
enzyme ở pH 7,5 [75, 124, 147]. IP