BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
HOÀNG ÁNH SÁNG
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ TRÀ SHAN TUYẾT HÀ GIANG CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC
MÃ SỐ: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

để tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, 16 tháng 11 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Hoàng Ánh Sáng LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật.
Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài, tôi có
sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả
được trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Hoàng Ánh Sáng

dạng khác nhau 8
1.5. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 12
1.6. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 13
1.7. Trà Shan tuyết Hà Giang 17
3.1. Sản phẩm kombucha sử dụng phân lập vi khuẩn 31
3.2. Ảnh mẫu vi khuẩn X
4
nhuộm Gram 32
3.3. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn 32
3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 35
3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X
4
trên môi trường thạch đĩa 36
3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X
4
trên môi trường thạch nghiêng 37
3.7. Hình thái của chủng vi khuẩn X
4
và 4 chủng vi khuẩn X
1
, X
2
, X
5
, và X
6

trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần 37
3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X
4

4
bổ sung hàm lượng
KH
2
PO
4
1,0 và 1,5 (g/l) 46 3.13. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X
4
với thời gian lên
men 5, 7 và 9 ngày 49
3.14. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X
4
ở nhiệt độ 20
0
C
và 30
0
C 52
3.15. Quy trình lên men Kombucha quy mô phòng thí nghiệm 54
* Danh mục bảng
1.1. Thành phần hóa học trà kombucha 15
2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28
2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 29
2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 29
3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 38
3.2. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5
chủng vi khuẩn Acetocbacter 39

LỜI CAM ĐOAN 3
TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC HÌNH, BẢNG 5
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 1
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Những đóng góp mới của đề tài 2
6. Phương pháp nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tổng quan về Kombucha 4
1.1.1. Sơ lược về kombucha 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo kombucha. 7
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 8
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 14
1.2. Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 16
1.2.1. Phương pháp sản xuất trà 17
1.2.2. Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 17
1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới 18
1.3.1. Trên thế giới 18
1.3.2. Ở Việt Nam 19
CHƯƠNG 2 21
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21
2.1.1. Đối tượng 21
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21
2.1.3. Môi trường 22

3.4.2. Thuyết minh quy trình 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58
1. Kết luận 58
2. Kiến nghị 58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

1MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Kombucha là thức uống lên men có lợi cho sức khỏe, đã được nhiều
người biết đến với các tên gọi khác nhau “trà nấm”, “thủy sâm”, “thủy hoài
sâm”… nó có vị ngọt và hương thơm của rượu táo lên men.
Trên thế giới, kombucha đã được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên
gọi khác nhau như: Machurian, Mo-Gu, Kocha kinoko,… Ở Việt Nam,
kombucha mới chỉ được lên men tại hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu
như trà xanh, trà lipton…. Cách tạo sản phẩm kombucha được nhiều người
quen gọi là “cách nuôi nấm thủy sâm”, nhưng bản chất là quá trình
các vi sinh vật truyển hóa đường (trong dung dịch trà đường) thành acid với
một lượng nhỏ hàng trăm các sản phẩm phụ khác nhau. Chất lượng thành
phẩm kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ môi trường, thời gian
lên men, độ pH của dung dịch, loại trà, thành phần các vi sinh vật,…
Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò rất quan trọng để tạo ra sản phẩm kombucha
thơm, ngon, đặc trưng.
Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu
về nấm men, vi khuẩn, tác dụng của kombucha…Tuy nhiên, chưa có
nghiên cứu nào đánh giá đầy đủ về sự về sự ảnh hưởng của vi khuẩn,

6.2. Phương pháp hóa sinh
Phát hiện hoạt tính catalase; khả năng oxy hoá acid acetic; chuyển hóa
glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng trên môi trường Hoyer; phương
pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N
có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả năng tổng hợp cellulose.

36.3. Phương pháp cảm quan.
Đánh giá sản phẩm theo TCVN 3217 – 79.
6.4. Phương pháp toán học 4NỘI DUNG
1. CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Kombucha
1.1.1. Sơ lược về kombucha
Trong sách thuốc cổ Trung Quốc, vào thời Tần Thủy Hoàng, năm 221
trước Công nguyên, người ta đã ghi chép về một loại “Thiên Trà”, trà này
được xem là một phương thuốc trường sinh. “Trà” được đưa vào Nhật do
một y sĩ người Triều Tiên tên là Kombu (và được gọi tên là “Trà Kombu”).
Sau đó được lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nước Đông Âu. [54].
Tuy nhiên, theo GW Frank trong tập sách “Kombu” (1991) thì kombu là
tiếng Nhật để gọi một loại rong biển và “cha” là trà và kombucha phát xuất từ

Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự
lên men cộng sinh của vi khuẩn và nấm men, “con nấm” này được các nhà
khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học – là một tổ hợp vi sinh vật
trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và
sinh ra các ngoại cao phân tử EPS – Extracellular Polymeric substance).
Con nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian
nuôi cấy và độ pH của môi trường.
Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc
trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Kết quả là kombucha có thể tương
đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường. Các vi khuẩn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26].
Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại
nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên
men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp.
6Nếu quá trình lên men bị nhiễm nấm mốc, có thể nhận thấy bằng
mắt thường như trên bề mặt “con nấm” có xuất hiện màu xanh lá cây,
xanh dương hoặc màu đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm
mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum…
Các loại nấm mốc trên sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là
các độc tố và gây mùi khó chịu.

Hình 1.1. Kombucha bị nhiễm nấm mốc
Trà kombucha là một loại thức uống bổ dưỡng. Quá trình lên men sản
sinh ra nhiều chất có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid
glucuronic, acid lactic, acid acetic và vitamin B (B1, B2, B3, B5, B6, B15…),
các hợp chất hữu cơ khác như PABA, acetamidophenol, cafein… [24], [28].



Hình 1.4. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau
Người ta có thể dùng trà xanh, trà đen, chè xanh, trà lipton để làm
môi trường lên men kombucha. Các loại trà khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm
kombucha có ra mùi vị khác nhau.
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc).
Chúng phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong
phú trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại
thực phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa
ethanol như rượu, bia, giấm tự nhiên… Bên cạnh những mặt có lợi trong lên
men như giấm, vi khuẩn acetic được xem là một trong những nguyên nhân
quan trọng gây hư hỏng thực phẩm tươi và thực phẩm lên men giàu cồn.
Họ vi khuẩn Acetobacteraceae (Gillis và de ley, 1980) bao gồm:
Chi Acetobacter (Beijerinck, 1898);
Chi Gluconobacter (Asai, 1935);
Chi Acidomonas (Urakami et al., 1989);
Chi Gluconacetobacter (Yamada et al., 1998);
Chi Asaia (Yamada et ai., 2000);
Chi Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002);
Chi Swacharibacter (Jojima et al., 2004);
9Chi Neoasaia (Yukphan et al.,2006);
Chi Granulibacter ( Greenberg et al., 2006).
* Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh
họ Acetobacteriaceae:

3
1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid
từ ethanol; tạo sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong
môi trường chứa D- glucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton
từ glcerol; phát triển trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển
sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là:
D-glucose, D-mamnose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-xylose,
arabinose, L-arabinose, D-malnitol, D-sorbitol, glycerol, maltose, lactose,
melibiose, sucrose, raffinose và ethanol [31], [49].
1.1.3.2. Nấm men
Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,
thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước
trung bình: chiều dài: 9 – 10

m, chiều rộng: 2 – 7

m. Hình dạng và kích
thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào
nhân chuẩn, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo
chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng sinh chất,
chất nguyên sinh, nhân tế bào và những thành phần khác: không bào, ty thể,
riboxom,…[4].
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách
nảy chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử.
Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces)
và nấm men giả (Fungi imperfecti). Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong
công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces.
Lớp nấm men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida,
Geotrichum, Rhodotorula.

. Sau khi được
vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo
chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất
này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol
chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm
lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong
những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
12
Hình 1.5. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP +2Pi
→ 2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP
Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO

2
O
CH
3
CHO + H
2
O → CH
3
CH(OH)
2
(Hydrat acetaldehyde)
CH
3
CH(OH)
2
+ O
2
→ CH
3
COOH + H
2
O Hình 1.6. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic
14* Lên men lactic:
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP

6
 CH
3
CHOHCOOH + CH
3
COOH + C
2
H
5
OH + COOH(CH
2
)
2
COOH + CO
2
Glucose acid lactic(40%) acid acetic ethanol acid succinic
Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid
lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%,
ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%.
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha
Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không
sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều
tinh dầu. Loại trà như Earl Grey có chứa dầu thơm Bergamot, có thể làm cho
15kombucha bị chết hoặc bị ảnh hưởng xấu. Sử dụng các loại trà khác nhau
sẽ cho ra những loại thức uống với những hương vị khác nhau.
1.1.5.1. Thành phần hóa học của kombucha

1.1.5.3. Một số lưu ý khi sử dụng
Do trà chứa nhiều acid lactic, uống quá nhiều, trong một thời gian dài
không có lợi cho sức khỏe, có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt, viêm xoang;
trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng và cần phải
được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới 2 tuổi uống; phụ nữ
có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà, không nên
uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; người tiểu
đường không nên uống nhiều vì hàm lường sót kombucha vẫn còn khá cao
(5-8 mg/l); Trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một
tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên
ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần. Men trà kombucha có thể bị
hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [34], [36], [50]
1.2. Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang
Trà Shan tuyết là từ dùng để gọi các loại trà được sản xuất từ búp cây
chè cổ thụ, mọc trên các vùng núi cao (trên 1.000m so với mặt nước biển).
Chúng thuộc giống chè cổ thụ 200-300 năm tuổi, búp chè phủ một lớp lông tơ
mịn như nhung, trắng như tuyết, bởi thế người ta gọi là chè Shan tuyết (có
người cho rằng chữ “Shan” là chữ gọi chệch của “Sơn”). Ở nước ta có nhiều
vùng chè Shan tuyết như: Thái Nguyên, Hà Giang, Tuyên Quang, trong đó,
Hà Giang là vùng sản xuất trà Shan tuyết nổi tiếng và lâu đời nhất nước ta.
Ngay từ những năm đầu thế kỷ 20, người Pháp đã tiến hành điều tra cây chè
ở Hà Giang và đặc biệt chú ý những cây chè cổ thụ vùng cao.
Về giống chè Shan Hà Giang có thể chia thành 2 dạng chính đó là chè
shan lá nhỏ, tiêu biểu chè Lũng Phìn (Đồng Văn), Phìn Hồ (Hoàng Su Phì)
với đặc điểm dạng tán hình mâm xôi hoặc dạng nến. Dạng chè shan thứ 2 với
tiêu biểu vùng chè cổ Bó Đướt, Thượng Sơ (Vị Xuyên). Loại chè này đặc biệt
nhiều về mức độ lông tuyết ở cả búp lá 1 và một phần lá 2. Cây chè càng già
17