BỘ Y TÊ'
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THỊ THANH HUYỂN
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN ,
KHÁNG NẤM CỦA MỘT s ố DẪN c h ấ t
5 - NITROFURFURAL
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC s ĩ KHOÁ 1997 - 2002)
NGUỜI HUỒNG DẪN : T.s CHU THỊ LỘC
TH.S ĐINH THỊ THANH HÁI
NƠI THỤC HIỆN ; BỘ MÔN VI SINH HỌC'
THỜI g Ìa N thục hiện : 01/3/2002 - 28/5/2002
HÀ NỘI THÁN(Ỉ 5 - 2002
£ ề í e ả ề ề L Ờ9L
^ ) ố i n iề m líú ih . tr/mxỊ. ữ à Lồ ng , ỉĩiỀ t đ tt iA u . ỉẤ e , e m æ ù i e h ú t t t íù u ih . eAtn.
Ố*L ^ĩỉỈMÍt th ị 'JCài^ ^.S- &tML t ít ị <£ệ^ đ ă tậ n tìn h ehí tmtì- OÁ
hưâng. dẫti em hiMUL thành, tếí kítơú ItJián. nàụ,.
ốm. củng, æùt bùụ. tở- Lờttq. b iâ ơn. tổ i OliỊunỉ n. QfMÂunjq, ^ ạ t,
3 C ^ Qlạâtụễn. (Ị)ăn. s^ỉn. eùnjQ, íóỉư i thè. cáe ihầy, eê- ạióbO- tễ(ô*ig. (Bộ- mởn 'Tũúú.
lútu. CỂỈ- OỈL (Bỗ- mòn. iln íi hjờc. đã. ehtì- ent nhữitg, Lài ehi d ẫ tt (ịu í (%áu úà. tọiO-
¿DỀu kiện ttuiẠn Lời đẽ. em ÚuỊe. hiỀtt tố t liíậ ti ũăn. lố t ttạhiÂ^L eỉUL m ình.
(X>in. edm Ơ*L q la đ in h OÁ bẹưt Ixè đ ã ctậnụ. lùêtt aà qiújfL đẵ lờ i tmng.
iỉLốl títằ i gẦxurt lồ i th ite fùjên. kPtoú. luân.,
'TCà, QĨẠi njgÁụ. 2 7 tháng. 5 nAitt 2002
Sinh. aìẦn
^ tiạ m íh i Çiftxjuth. 'ĨCuựỈM.
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn để Ị
Phần 1 - Tổng quan 2
1.1. Tổng hợp và tác dụng sinh học của dẫn chất 5- nitrofurfural. 9
1.1.1. Cấu trúc hoá học & tác dụng kháng khuẩn của các thuốc

tăng thì việc tìm ra những kháng sinh mới, những thuốc kháng khuẩn, kháng
nấm mới có hoạt lực mạnh hơn, phổ tác dụng rộng hơn là một yêu cầu cấp
thiết.
Từ lâu, nhiều dẫn chất nitrofuran đã được dùng làm thuốc kháng khuẩn
như Nitrofurantoin, Nifuratel, Furazolidon [14]. Ngoài ra, còn được sử dụng
trong điều trị một số bệnh do kí sinh trùng gây ra như Nifuroxim (điều trị
bệnh do Trichomonas), Nifurtimox (điều tri bệnh Chagas do Trypanosoma
cruzi) [14,20,29].
Vái đề tổng hợp và nghiên cứu tác dụng sinh học của các dẫn chất 5 -
nitrofurfural vẫn đang được quan tâm ở cả trong và ngoài nước [4,8,15,22,24].
Trong hai năm gần đây, Nguyễn Quang Đạt, Đinh thị Thanh Hải và
cộng sự [4,5,13] đã công bố kết quả tổng hợp và sơ bộ thăm dò tác dụng
kháng khuẩn, kháng nấm của hai dãy chất gổm 24 dẫn chất được tạo ra bằng
phản ứng ngưng tụ 5 - nitrofurfural với các hợp chất có nhóm methylen hoạt
động là: thiazolidin —2,4 -dion, 2 -thioxo 4 -thiazolidinon (rhodanin) và các
dẫn chất base Mannich của chúng. Các kết quả thăm dò sơ bộ cho thấy các
dẫn chất này có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Candida albicans khá
mạnh.
Hấp dẫn hởi kết quả công bố trên, trong khoá luận này, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 24 dẫn chất 5-
nitrofurfural với các mục tiêu như sau:
1. Thử định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 24 dẫn chất.
2. Xác .định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 4 dẫn chất.
3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của 4 dẫn chất.
Từ kết quả nghiên cứu có thể sơ bộ kết luận về mối liên quan giữa cấu
trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nán của một số dẫn chất 5 -
nitrofurfural. Với các mục tiêu ttên, chúng tôi hy vọng sẽ đóng góp một phần
nhỏ bé vào việc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của dãy chất
này.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN

C = N — N— c

( X = o, s,-NH )
X
Bảng 1. Một số thuốc kháng khuẩn thuộc dãy Nitroíuran [11,14,20,29].
STT Công thức cấu tạo Tên gốc
Tên biệt
dược
Công dụng
1
NF-CH = N-NH - CO - NH2
Nitrofurazon Puracin,
NFZ,
Nitroíural,
Puracilin
Điều tậ nhiễm
khuẩn ngoài
da (vết ứiương,
vết bỏng)
2
NF-CH=N-NH-OC— OH
Nifuroxazid
Erceíuryl,
Pentoíur
Điều trị nhiễm
khuẩn đường
ruột, Iv trực
khuẩn, viêm
ruột kết mạn
và bán cấp.

có sự liên hợp sau:
ứ l
N Í n H - C - Y
á .
Nếu kéo dài mạch liên hợp hoặc đưa nhóm phân cực vào thì nhóm này
sẽ tưofng hỗ với nhóm nitro nhận điện tử làm tăng tác dụng kháng khuẩn. Nếu
thêm nhóm ion hoá mạnh vào thì làm giảm khả năng hấp thu trên tế bào vi
khuẩn dẫn tới làm giảm tác dụng kháng khuẩn.
* Cơ chê tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural.
Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural có thể
được trình bày như sau:
Dẫn xuất nitrofuran ức chế chu trình Krebs của tế bào vi khuẩn, làm
giảm sản xuất năng lượng cần cho sinh sản và tổn tại của vi khuẩn. Với nồng
độ vừa phải, thuốc ức chế tổng hợp ADN, ARN của vi khuẩn, nồng độ gấp đôi
làm ngừng hẳn tổng hợp ADN, ARN. [11]
Một tài liệu khác [22] đã công bố rằng cơ chế tác dụng kháng khuẩn
của các dẫn chất nitrofuran có liên quan tới sự khử nhóm nitro bỏi enzym khử
nitro của vi khuẩn, thành các chất trung gian như gốc nitro, nhóm nitroso,
hydroxylamin và cuối cùng là nhóm amin. Các chất trung gian này ở dạng
nguyên thể hay sau khi acetyl hoá đã tưorng tác và làm tổn thưoíng ADN của vi
khuẩn.
Theo cơ chế trên, Akerblom E.B. [19] còn nhận xét thấy mối liên quan
giữa thế khử của nhóm nitro và hoạt tính kháng khuẩn. Các chất nitrofuran có
nhóm carbonyl liên hợp ở vị trí 2 có thể bị khử dễ dàng do gốc anion [la]
được tạo thành trong giai đoạn khử đầu tiên có thể được ổn định do sự liên hợp
'ö-
JQ'
'N'
'0
la

nhòfn thuốc của vi khuẩn:
O2N o CH = N - CHPhCO - N—
CH3
-CH3
\
COOH
Ngoài các dẫn chất nitrofuran có cấu trúc được nối với gốc R bằng cầu
azomethin và hvdrazon, việc gắn trực tiếp các niưoũiran với các ceton- a, Ị3-
ethylenic là một hướng nghiên cứu mới rất đáng quan tâm. Kết quả nghiên
cứu của Nazarova và Babeschkina [37] cho thấy các dẫn chất này có tác dụng
ỉcháng khuẩn rõ rệt như chất 3- methvl-3- (5’- nitro- 2'- furyi)- 3- buten- 2- on.
O2N
CH
. C - S o
b r
L.Ya.Ladnaya và N.M.Turkevich [28] đã lổng hợp và thừ tác dụng
kháng khuẩn của các dẫn chất ngưng tụ của 5- nitrofurfural với thiazolidin -
2,4 - dion:
-NH
O2N o (CH =CH)n-CIÍ^^^^^S^^O (n-0, 1)
R = H ; 5 - Br ; 6 - C1
Các chất này có tác dụng mạnh với các vi khuẩn đường ruột.
Nhà nghiên cứu Thuỵ Điển Akerblom E.B. [19] đã tổng hợp và thừ tác
dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 5- nitrofurfural mà phân tử có chứa gốc
5- nitrofuryl, nhóm ceton - a, p - ethylenic, nhân thiazolidin - 2,4 - dion,
nhân rhodanin:
O2N' 'O
(CH==CH)n-i-cir
N— R,
n=0, 1 ; Ri=H;alkylíl2 = 0,S

ì
0
02N'
02N'
( 2 )
^ \ CH3
CH = Ọ-C=N-B
CH3
N-B
'1 1
C—CH3
'O
( 4 )
CH =
C—CH3
ì
0
Kết quả thử tác dụng sinh học sơ bộ cho thấy chất 1, 3 và các dẫn chất
có tác dụng kháng khuẩn và idiáng nấm Candida albicans mạnh.
Trong hai năm gần đây, Đinh thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt và
cộng sự [4,5,13] đã công bô' kết quả tổng hợp và thử hoạt tính kháng Iđiuẩn,
kháng nấm của ba dãy chất được tạo ra bằng phản ứng ngưng tụ 5 -
nitrofurfural vói các hợp chất có nhóm methylen hoạt động như: thiazoiidin -
2,4 - dion, 2 - thioxo 4 - thiazolidinon (rhodanin), imidazolidin - 2,4 - dion
(hydantoin) và các dẫn chất base Mannich của chúng.
-N-H
0,N 0
^ S '^ 0
-N-ỉĩ
0

quan tâm.
1.2. Khái quát chung về vi sinh vật.
1.2.1. M ột số đặc điểm chung về vi sinh vật [2,6,9].
Vi sinh vật (VSV) có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất.
Từ lâu con người đã nhận thức được sự tồn tại của chúng và đã có nhiều ứng
dụng ừong đời sống. Nhưng chỉ đến năm 1675, khi Lewwenhook người Hà
Lan, phát minh ra chiếc kính hiển vi có sức phóng đại 270 lần thì con người
mới quan sát được hình dạng của chúng. Và Louis Pasteur, nhà khoa học vĩ
đại người Pháp với những phát kiến quan trọngcủa mình đã mở đầu một kỷ
nguyên mới trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh lý học v s v .
v s v gồm có v s v nhân thật (Eucaryotes) và v s v nhân nguyên tíiuỷ
(Procaryotes) [9]. Chúng có kích thước rất nhỏ bé (thường tính bằng micromet
hoặc nanomet) nhưng hấp thụ nhiều và chuyển hoá nhanh. So với các sinh vật
khác thì v s v có tốc độ sinh trưởng và phát triển cực kỳ lớn. Trong điều kiện
nuôi cấy thích hợp, trung bình cứ 20’ - 30' có một chu kỳ phân chia tế bào gọi
là thời gian thế hệ. Qiúng có khả năng thích ứng mạnh với các biến đổi bất lợi
của môi trưòíng và cũng rất dễ phát sinh ra biến dị. Những biến dị này có ũiể
có lợi (ví dụ làm tăng hiệu suất sinh kháng sinh) hoặc có hại (ví dụ xuất hiện
khả năng kháng thuốc).
* Vi khuẩn (VK) là những v s v nhân nguyên thuỷ (Procaryotes). Người
ta phân loại chủng dựa theo nhiều yếu tố khác nhau:
- Theo hình dạng, chúng có 3 loại chủ yếu là :
+ VK hình cầu: Tụ cầu ( Ví dụ: Staphylococcus aureus)
Song cầu ( Ví dụ: Diplococcus pneumonia)
+ ỴK hình que: Ví dụ: trực khuẩn ũiương hàn Salmonella typhi,
trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào Bacillus subtilis
+ VK hình xoắn: Ví dụ: phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae, xoắn
khuẩn giang mai Treponema pallidum.
- Theo tính chất bắt màu Gram, người ta chia VK ra làm 2 nhóm là VK
Gram(-) và Gram (+).

vật khác. Chúng có vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hoá vật chất
nhưng đồng thời có rất nhiều loaị v s v gây bệnh cho người và động thực vật.
Trong khoá luận này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 10 loài v sv
hay gặp nhất, gồm 9 loài vi khuẩn và một loài vi nấm.
* Esherìchia coli ( trực trùng đại tràng)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), không sinh nha bào, có lông.
- Hô hấp: hiếu khí hoậc kị khí không bắt buộc.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông
thưòng. Điều kiện thích hợp là pH = 5,5 - 8; 1*"= 3TC.
+ Môi trường canh thang; gây đục, để lâu có cặn, có mùi thối đặc
biệt.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc trắng xám, nhờn, bóng.
- Khả năng gây bệnh: E.coli sống cộng sinh nhưng có thể gây nhiễm
trùng cơ hội như viêm đường ruột, sinh dục, tiết niệu
* Salmonella typhi (trực khuẩn thương hàn)
- Đặc điểm hình thái: Trực khuẩn Gram (-), không sinh nha bào, có
lông toàn thân.
- Hô hấp: kị khí không bắt buộc.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông
thường.
+ Môi trường canh thang: đục đều có vẩn.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc trắng đục, bờ đểu, nhẩn
bóng.
- Khả năng gây bệnh: gây bệnh thương hàn, nhiễm độc thức ăn
* Shigella ýlexneri (trực khuẩn iỵ)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-), khổng sinh nha bào, khổng
có lông.
- Hô hấp: hiếu khí boậc kị khí tuỳ tiện.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trưèfng canh thang: đục đều, lắc có vảy óng ánh.

- Đặc điểm hình thái; cầu khuẩn Gram (+) mọc thành từng đám, không
hình thành nha bào, không di động.
- Hô hấp: hiếu khí hoặc kị khí tuỳ tiện.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát ttiển trên môi trường nuồi cấy thông
thưòmg.
+ Môi trường canh thang: sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau
24 giờ có hiện tượng lắng cặn.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc tương đối tròn, mép đểu
đặn, màu vàng sẫm.
- Khả năng gây bệnh: có thể gây nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm trùng
huyết, nhiễm độc thức ăn, viêm một cấp
* Bacillus cereus
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (+), có khả năng sinh nha bào.
- Phân bố: có nhiều trong không khí, đất, phân bón.
- Đặc điểm nuôi cấy:
+ Môi trưòmg canh thang: làm đục môi trường.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc màu trắng đục.
- Khả năng gây bệnh: không gây bệnh.
* Bacillus pumỉlus
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (+), có khả năng hình thành nha
bào.
- Phân bố: có nhiều trong không khí, đất, phân bón.
- Đặc điểm nuôi cấy;
+ Môi trường canh thang: làm đục môi trường.
+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc màu trắng sữa, bể mặt
nhẵn.
- Khả năng gây bệnh: không gây bệnh.
* Sarcina lutea
- Đặc điểm hình thái: bát luỹ cầu, Gram(+), mọc thành chùm tíieo hình
lập phương, có từ 6 - 8 coccus.

nhau:
l.3.1.1. Cấy theo đườm thẳns góc.
Trên đĩa thạch dinh dưỡne đục một rãnh thẳng dọc theo đường kính
hoặc theo một đường cát tuyến ở mép hộp. Cho chất thử vào rãnh đã được làm.
Sau đó cấy các v sv chỉ thị thành những đường thẳng góc và sát với rãnh chất
thử. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát vùng ức chế vsv. Hoạt tính kháng khuẩn
được sơ bộ xác định bằng cách đo khoảng cách từ rãnh chất thử đến chỗ v sv
bắt đầu phát triển.
ưu điếm của phương pháp này là có thể thử tính ức chế của chất thử
với nhiều chủng vsv trên cùng một đĩa Petri.
1.3.12. Dùns ốns thép khôns sỉ.
Trên mặt đĩa thạch dinh dưỡng có trộn v s v chỉ thị, đặt các ống thép
không gỉ hình trụ có kích thước: cao lOmm, đường kính ngoài 8mm, đường
kính trong 6mm. Cho chất thử với một lượng bằng nhau vào các ống trụ. Sau
thời gian nuôi cấy, đo vòng vô khuẩn được tạo thành quanh ống trụ.
13.1.2. Đuc lỗ thach.
Dùng khoan nút chai hoặc dụng cụ riêng vô trùng để đục lỗ trên đĩa
thạch dinh dưỡng đã có v s v chỉ thị tạo các lỗ có đường kính 6-7mm, chiều
cao 7-8mm. Cho chất thử vào lỗ thạch. Đo vòng vô khuẩn được tạo thành sau
thời gian nuôi cấy.
1.3.1.4. Dùns khoanh siấy loc.
Phương pháp này được dùng khá phổ biến để xác định tính mẫn cảm
của v s v với các chất kháng khuẩn. Đặc biệt được dùng nhiều trong bệnh viện
để làm kháng sinh đồ [10].
Các khoanh giấy sắc ký có đường kính 7 - 8mm được tẩm chất thử với
một hàm lượng nhất định theo mục đích nghiên cứu. Để khô ở 37”c - 40‘’c.
Đặt các khoanh giấy này lên mặt đĩa thạch dinh dưỡng đã có v s v chỉ thị. Đo
vòng vô khuẩn sau thời gian nuôi cấy.
1.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởns đến kích thước vòns vô khuẩn.
Kích thước vòng vô khuẩn có thể bị thay đổi phụ thuộc vào độ dày của

' Mức độ nhạv cảm của
; vsv
1
i
Khoảng nồng độ ức chế
trèn invitro
1
Liều yêu cầu để đạt
được nổns độ ức chế
trên invivo
-rất nhạy cảm
<4mg/ml
20-25mg/kg/ngày
(0,5g/lx3/ ngày)
-nhạy cảm
4-7mg/ml
30-50 mg/kg/ngày
(lg/lx3/ngày)
-nhạy cảm vừa phải
7-lOmg/ml
60-7 Omg/kg/ngày
(l-l,5g/lx4/ngày)
-kháng
>10mg/ml
Không thực hiện được ở
điều kiện thông thưòíng '
Việc xác định MIC được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu các thuốc
kháng sinh và các chất kháng khuẩn. Nó đánh giá được hoạt lực tác dụng của
thuốc với VK và mức độ nhạy cảm của chúng. Dựa vào giá trị MIC50 và
MIC90 ngưòi ta có thể xác định được mức độ nhạy cảm của một loài vsv với

trong mỗi ống khoảng 10^ tế bào/ml. Sau thời gian nuôi cấy, xác định nồng độ
thấp nhất của chất thử ức chế hoàn toàn sự phát triển của v sv .
1.3.3. Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
[25,31,33].
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC = Minimal Bacteriostatic
Concentration) là nồng độ nhỏ nhất của một kháng sinh có thê ngăn chặn sự
phát triển của một v sv sau khi đã được cấy truyền sang môi trườns đặc
không có kháng sinh, hoặc là nồng độ kháng sinh mà ở đó 99,9% số tế bào
của vsv bị tiêu diệt [33].
Trẽn lâm sàng MIC thường được sử dụng nhiều hofn nhưng việc xác
định MBC cũng có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân bị suy
giảm miễn dịch nghiêm trọng hoặc những bệnh nhân cần đạt được mức độ tối
ưu trong điều trị nhiễm khuẩn [33].
Người ta thưorng tiến hành xác định MBC ngay sau khi xác định MIC
bằng cách cấy truyền những ống không có vsv phát triển trong xác định MIC
sang môi trường dinh dưỡng đặc không có kháng sinh, ở nồng độ thấp nhất
mà VK không phát triển lại đirơc sau thời gian nuôi cấy là MBC.
PHẨN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phưong pháp thực nghiêm.
2.1.1. Nguyén liệu
2.Ỉ.Ỉ.I.Hoáchất
24 Chất là sán phám ngưng tụ của 5 - nitrofurfiiral với thiazolidin- 2.4-
dion, 2- thioxo 4- thiazoiidinon và các dẫn chất base Mannich có côna thức
được ghi ở bảng 3.
2.1.12. Môi trườns dinh dưỡns:
* Môi trường thạch nền (MTl)
Thạch
: 18,Og
Nước cất vđ : lOOOml
* Môi trường cao thịt - cao men (MT2)

Cao thỉt
Glucose
pH = 7,2±0,2
1.5g
l,Og
Glucose :
pH = 5,8±0,2
20,0g
Các môi tnrờng được hấp tiệt trùng ở 1 atm/ 20'
lĩiíng 3: công thức 24 dẫn chất 5 - nitroturtural
o. ,Ri
N— (CH2— N )n < ^ '
O2N o'
'CH
( 'hâl n
R.
R2
.

7‘^ ' '
R 3
1
0
II
2 1 CH3
CH3
0
3 1 ■ •' M
C4H9
0

0
11
s
14
1 C2H5 C2H5
s
15
1
It
C4H9
s
l<»
1 II
s
17 1 M
s
18
1 M
.s
19
1
II
s
20 1 II
^ 0 > - '
s
21
—H ^0
s
22 1

2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
- Thử định tính tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch (Dược điển Việt Nam).
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng
liên tục của Stephen Gillespie [31].
- Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng phương pháp của
Stephen Gillespie [31].