BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
TRẦN DUY DƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ
NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO
(DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả
Trần Duy Dương
ii
LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo và Khoa sau đại học
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Phó Giáo sư, Tiến
sĩ Lã Tuấn Nghĩa và Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Thủy, những người thầy tâm
huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi
và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Khuất Hữu Trung,
Tiến sĩ Trần Hoàng Dũng, Kỹ sư Nguyễn Trường Khoa, các bạn bè đồng
nghiệp Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tạo điều
kiện và giúp đỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm
để hoàn thành bản luận án.
Cuối cùng, tôi xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình của tôi là nguồn
động viên và truyền nhiệt huyết để tôi hoàn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn!

Deoxyribonuclease
dNTP
Deoxyribounucleotide triphosphate
ddNTP
Dideoxyribonucleotide triphosphate
EDTA
Ethylenediamine tetraacetate
EtBr
Ethidium bromide
HT
Hoàng Thảo
ISSRs
Inter-simple sequence repeats
EDTA
Ethylenediamine tetraacetate
ITS
Internal transcribed spacer
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
ML
Maximum Likehood
matK
Maturase K
ln
likelihood
mtDNA
Mitochondrial DNA
iv
NCBI
National Center for Biotechnology Information

Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris/Borate/EDTA
T
m

Melting Temperature
U
Unit
UV
Ultraviolet
V
Voltex
ΣDNA
DNA tổng số

v
DANH MỤC BẢNG BIỂU
TT
bảng
Tên bảng
Số trang
2.1
Tên và trình tự các mồi RAPD trong nghiên cứu…
42
2.2
Thành phần và thể tích các chất trong phản ứng PCR…
42
2.3

70
3.5
Thống kê số băng ADN được nhân lên ở các mẫu giố
ứuvới 20 mồi RAPD

94
3.6
Tổng hợp kết quả phân tích số liệu với 20 mồi RAPD
99
3.7
Độ dài trình tự ITS của 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng
Thảo
111
3.8
Độ dài trình tự của vùng ITS mẫu giống D1 và hai mẫu
giống D. fimbriatum của thế giới

113
3.9
Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D2 và D18 và
hai mẫu giống D. findlayanum của thế giới

115
3.10
Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D4 và hai mẫu
giống D. anosmumcủa thế giới

116
3.11
Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D10 và hai mẫu

3.1
Các mẫu giống Hoa lan Hoàng Thảo được trồng và chăm
sóc tại nhà vườn, 422 đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm,
Hà Nội……………………………………… 52
3.2
Hình dạng thân của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo…
59
3.3
Hình dạng lá của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo…
67
3.4
Một số kiểu hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
68
3.5
Hình dạng cánh môi các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
69
3.6
Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 32 mẫu
giống hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái

87
3.7
Ảnh điện di ADN tổng số của 32 mẫu giống hoa lan
Hoàng Thảo…………………………………………

92
3.8

3.14
Các mẫu giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5
(Trầm tím), D6 (Trầm trắng)

104
3.15
Hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều tím

viii
(D12), Kiều vàng (D13)và Kiều trắng (D14)
105
3.16
Hai mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo D24 (HT Vảy rồng lá
nhỏ), D25 (HT Vảy rồng lá trung)

106
3.17
Ảnh điện di đoạn ITS của quả 32 mẫu giống hoa hoa lan
Hoàng Thảo được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và
ITS4
110
3.18
Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự
vùng ITS của mẫu giống D1 và hai mẫu giống D.
fimbriatum |JN388588.1| và |HQ114229.1|

114
3.19
Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự
vùng ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D.

trên ngân hàng gen Blast
123
3.25
Sơ đồ cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS
125

ix
MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn .ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iii
Danh mục bảng biểu v
Danh mục các hình .vi
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Sơ lược về chi lan Hoàng Thảo 5
1.1.1. Hệ thống phân loại 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái 6
1.1.3. Phân bố vùng sinh thái 9
1.2. Giá trị sử dụng của hoa lan Hoàng Thảo 11
1.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và
xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 12
1.3.1. Khái niệm về đa dạng di truyền 12
1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 13
1.3.3. Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ
thị nhận dạng ở thực vật 13
1.4. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 23

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 136
TÀI LIỆU THAM KHẢO 138

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Họ lan, hay họ phong lan, (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc
bộ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotydonea). Đây là một
trong những họ lớn nhất của thực vật bao gồm 800 chi khác nhau, chúng được
phân bố ở trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực (Trần Hợp, 1989;
Huang và Chen, 2010).
Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình
dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong
họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009). Vùng
Đông Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm
loài, riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân
Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân
bố rộng rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước.
Với một số lượng lớn các loài của chi lan Hoàng Thảo có giá trị như
vậy, cho đến nay vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá,
tư liệu hoá ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền tập đoàn hoa lan Hoàng
Thảo Việt Nam một cách sâu rộng, bài bản và có hệ thống. Do đó, việc đặt tên
cho từng giống vẫn rất lộn xộn từ những tên giống được dịch sang từ tiếng
Anh và tiếng Latin, có rất nhiều tên giống trùng nhau. Bên cạnh đó, việc di
chuyển các giống lan Hoàng Thảo giữa các vùng, các nước khác nhau đã gây
ra sự nhầm lẫn và hiểu sai về xuất xứ, nguồn gốc bản địa và mối quan hệ di
truyền giữa các giống với nhau. Điều đó gây ra không ít khó khăn trong việc
bảo tồn, khai thác có hiệu quả kể cả thương mại các giống hoa trên thị trường
trong nước và quốc tế.
Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực

3
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và
mức phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ
sở để tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo
giống mới;
- Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số
giống/loài lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn,
lưu giữ các nguồn gen quý, có giá trị kinh tế và đăng kí trên ngân hàng gen
thế giới.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Đề tài góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng
Thảo bản địa của Việt Nam;
- góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan
Hoàng Thảo quý hiếm của Việt Nam bảo tồn,
Phong l .
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Là các mẫu giống giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các
vùng miền Việt Nam.
4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc
Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014.
5. Những đóng góp của luận án
Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống
4
về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân
tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt

(1985) đều chia Dendrobium thành các nhóm khác nhau (section). Song cũng
có vài tác giả chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân chi
(subgennus) như Kraenzlin (1910) (Dressler, 1993; Leitch và cs., 2009).
Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ở Việt Nam
6
thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985). Hệ thống này rõ ràng, không
phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo
ở Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
1.1.2.1. Thân
Các đại diện của chi lan Hoàng Thảo rất dễ nhận biết ở ngoài thiên
nhiên. Đó là các cây thân thảo, mọc nhóm, , phân
đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc ít gặp các loài sống bám trên đá, trong
rừng ẩm. Tuy nhiên phân biệt các taxon trong chi gặp nhiều khó khăn bởi tính
đa dạng của chúng thể hiện ở cơ quan sinh dưỡng cũng như cơ quan sinh sản.
Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình
con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 3cm đến 120cm hoặc
đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50 cm (Trần Hợp, 1998).
Lát cắt ngang thân có thể hình tròn, , đôi khi hình 4 cạnh
nhưng gọi chung kích thước ngang này là chiều dày, thay đổi từ 0,3cm đến
1,5cm nhưng đa số hay gặp là khoảng 0, 5-1cm.
Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên. Phần dày mập
lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc hoặc sát ở đỉnh. Đôi khi phần dày lên
có hình con suốt có 4 gờ sắc. Ở cá biệt vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn
lóng thì hầu như không làm thân có dạng tràng hạt (D. pendulum) hoặc sự dày
lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D. nobile,
D. wardianum). Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là nhỏ
mảnh nhưng cũng không ít trường hợp phình to ra (Hoàng Thị Bé, 2004;
Dương Đức Huyến, 2007).
1.1.2.2. Lá

trên cánh môi (đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ) chiếm vị trí
8
khá quan trọng trong phân loại. Nhiều đại diện có gốc cánh môi dính với chân
cột tạo thành cựa.
* Cột hoa (trụ nhị-nhụy)
Cột hoa hay còn gọi là trụ nhị-nhụy, có khi còn được gọi là trụ, thường
thấp, mặt trước hơi lõm lòng máng; đỉnh cột lõm để chứa khối phấn, hai mép
đỉnh cột có 2 răng cột, phủ lên đỉnh cột là nắp bao phấn (thường gọi đơn giản
là nắp).
Ở gốc cột có mỏ, thường là một phần phụ, dạng màng nhô ra nhằm
ngăn cách bao phấn với nhụy (hốc đặt phấn). Chỗ thấp nhất phía dưới cột là
chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật. Bao phấn hình mũ, bề
mặt thường nhẵn hoặc có nhú mịn, đôi khi có lông bao phủ. Khối phấn hình
chùy, không có chuôi, số lượng là 4, xếp thành 2 cặp. Bầu hạ, thường nhỏ và
thon dần xuống cuống hoa, ranh giới giữa bầu và cuống hoa không rõ rệt, bầu
3 ô, rất nhiều noãn.
1.1.2.4. Quả
Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt
nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút
nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài. Hạt rất nhỏ, hầu
như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng, dạng mắt võng, trong
suốt, chứa đầy không khí, dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió.
So với những chi gần cận là Flickingeria, Epigenium, Eria thì
Dendrobium có những đặc điểm phân biệt căn bản sau đây:
- Các đại diện của chi Dendrobium luôn mọc nhóm và có thân phân đốt
chứ không mọc đơn độc trên thân rễ và chỉ có 1 lóng như các đại diện của
Flickingeria.
- Dendrobium luôn có số lượng khối phấn là 4 chứ không phải là 2 như
ở chi Epigenium hoặc 8 như ở Eria.
9

terminale Par et Rchb.f).
: Hoàng Thảo (D. oxyanthum
Gagn), Hoàng Thảo (D. tenellum Lindl).
: Hoàng Thảo Tua (D. hadveyanum Reichb.f), Hoàng
Thảo (D. hadveyanum Reichb.f), Hoàng Thảo (D.
formosum Roxb), Hoàng Thảo (D. fimbriatum Hook), Hoàng Thảo
(D. pierardii), Hoàng Thảo (D. gratiosissimum Reichb.f),
Hoàng Thảo (D. kentrophyllum Hook.f), Hoàng Thảo Môi tơ (D.
delacourii Guill), Hoàng Thảo Vani (D. aduncum), Hoàng Thảo Đại bạch hạc
(D. christyanum).
: Hoàng Thảo (D. anceps Sw), Hoàng
Thảo (D. cretaceum Lindl), Hoàng Thảo (D.
caryaecolum Guill), Hoàng Thảo (D. cathcartii Hook.f).
: Hoàng Thảo (D.acinaciforme
Roxb).
: Hoàng Thảo (D. lindleyi), Hoàng
Thảo m (D. anseps), Hoàng Thảo (D. capillpes), Hoàng Thảo
(D. chrysanthum), Hoàng Thảo (D. moschatum), Hoàng
Thảo (D. nobile), Hoàng Thảo (D. anosmum), Hoàng
Thảo (D. tortile), Hoàng Thảo (D. thyrsiflorum),
Hoàng Thảo (D. farmeri), Hoàng Thảo (D.
amabile), Hoàng Thảo (D. haveyanum), Hoàng Thảo
(D. chrysotoxum), Hoàng Thảo (D. draconis Rchb.f),
Hoàng Thảo Long tu (D. primulinum), Hoàng Thảo (D.
gratiosissimum), Hoàng Thảo (D. pierardii), Hoàng Thảo
(D. flavum), Hoàng Thảo (D. pucherrima), Hoàng Thảo Hoàng
11
lạp (D. chrysotoxum) (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004). Các đại diện của
chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc cành cây ở trong rừng hoặc
trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở độ cao 500-1500m so với mực

trồng lan tốn ít đất, không phải sử dụng đất của nông nghiệp. Trồng lan còn
tạo vùng cây xanh cho gia đình, làm không khí thêm trong lành, góp phần tích cực
bảo vệ môi trường, nhất là ở thành phố. Trồng lan còn nâng cao cuộc sống tinh thần
của chúng ta, giúp ta biết hưởng thụ và cảm nhận cái đẹp, biết yêu và bảo vệ thiên
nhiên (Nguyễn Văn Kết và cs ., 2005; Trần Duy Quý, 2005).
1.3. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và
xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật
1.3.1. Khái niệm về đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các
cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong
một loài và giữa các loài khác nhau.
13
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể
trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di
truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể.
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di
truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho
cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp
bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền.
1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã
tự nhiên và rất quan trọng đối với con người. Sự đa dạng di truyền là cần thiết
cho tất cả sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng của các
loại dịch bệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi trường
sống. Sự đa dạng di truyền ở cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong
chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con người.
1.3.3. Các phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị
nhận dạng ở thực vật
1.3.3.1. Phương pháp dựa vào chỉ thị hình thái
Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền