BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
 ðINH THỊ LAN NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ðIỀU KIỆN
CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM RHIZOGENES Ở SÂM NGỌC LINH
(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 06.472.0201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ
GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng
Hà, GS. TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Phạm Bích Ngọc ñã tận tình hướng dẫn,
giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và
hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn KS. Nguyễn Khắc Hưng, KS. Nguyễn
ðình Trọng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi
trong quá trình thực hiện nghiên cứu ñề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học
Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã hướng dẫn, truyền ñạt kiến thức cho tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình và bạn bè ñã
tạo ñiều kiện giúp ñỡ, ñộng viên tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn tốt
nghiệp.
Hà nội, tháng 07 năm 2014
Tác giả luận văn ðinh Thị Lan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I
LỜI CẢM ƠN II
MỤC LỤC III

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Vật liệu 30
2.2. Địa điểm, thời gian 30
2.3. Hóa chất thiết bị 30
2.4. Nội dung 30
2.5. Phương pháp thực hiện 30
2.5.1. Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
ATCC
15834
chứa gen gusA 31
2.5.2. Tiến hành chuyển gen vào sâm Ngọc Linh với chủng Agrobacterium
rhizogenes
ATCC
15834 để kiểm tra lại quy trình và cảm ứng ra rễ. 33
2.5.3. Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 37
2.5.4. Quy trình lây nhiễm 37
2.5.5. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen gus 38
2.5.6. Phương pháp kiểm tra dòng chuyển gen 39
2.5.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 39
2.5.8. Phương pháp PCR – Polymerase Chain Reaction 41
2.5.9. Các chỉ tiêu theo dõi 43
2.5.10. Xử lý kết quả 43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Khảo sát khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 có chứa gen gusA 44
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes 44
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48
3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen nhờ

Page vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A. rhizogenes

:

Agobacterium rhizogenes

AS

:

Acetosyringone

bp

:

Base pair

DNA

:

Desoxyribonucleic acid

GusA



:

Root locus

SH
:

Schenk và Hildebrandt, 1972

ss T-DNA
:

Single strain T-DNA

Vir

:

Virulence genes

WPM

:

Woody Plant Medium
YMB

:


3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng acetonsyringone (As) đến khả
năng tạo rễ tơ 58
3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đến khả
năng tạo rễ tơ 60
3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng tạo rễ tơ 62
3.11 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ 63
3.12 Ảnh hưởng của tổ hợp các điều kiện tới đến khả năng tạo rễ tơ 65
3.13 Ảnh hưởng của nước dừa và casamino acid tới sinh trưởng của rễ tơ 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cây sâm Ngọc Linh 5
1.2 Một số đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh 6
1.3 Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ 16
1.4 Cấu trúc Ri- plasmid 17
1.5 Cơ chế chuyển T-DNA của Ti-plasmid sang genome thực vật 21
1.6 Nuôi cấy rễ tơ 28
3.1 Kết quả thử vật liệu chuyển gen 46
3.2 Kết quả kiểm tra nồng độ AS 48
3.3 Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm 50
3.4 Kết quả kiểm tra ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy 52
3.5 Kết quả kiểm tra OD
600
53

của
sâm Ngọc Linh đã được nhiều nhà khoa học ở Việt
Nam
cũng như trên thế giới nghiên cứu và
chứng
minh là cây thuốc quý dùng để
chữa nhiều bệnh và tăng cường sức khỏe như tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ
thể
chống stress, tác động lên hệ miễn dịch,
tăng
sức đề kháng cho cơ thể, giúp
chống viêm,
ngăn
cản sự lão hóa, v.v (Duc N.M et al., 1996).
Theo các nhà khoa học sâm Ngọc Linh có tác dụng kích thích hệ miễn dịch,
chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, hoạt
động trí tuệ và cải thiện thể lực, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp, có tính
kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu.
Chính vì vậy mà
sâm
được xem là vị thuốc quý, đứng đầu các
vị
thuốc bổ
theo thứ tự Sâm, Nhung, Quế,
Phụ
trong y học cổ truyền, đã được sử dụng từ
rất
lâu đời ở các nước trên thế giới cũng như ở
Việt
Nam (Đỗ Tất Lợi,

cũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu.
Vấn đề đặt ra là cần triển khai, phát triển sinh khối tế bào thực vật, tạo nguồn
nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc. Nhân sinh khối tế bào thực vật đã
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất
phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa bảo tồn
nguồn gen quý hiếm. Nhiều hoạt chất nguồn gốc từ thực vật có giá trị kinh tế cao là
sản phẩm từ sinh khối tế bào thực vật như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào
Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây Coptis japonica.
Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối các loài
sâm ứng dụng trong các lĩnh vực y dược. Một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ
nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng làm thuốc bổ, thuốc phòng chống
bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương,
các loại mỹ phẩm.
So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ sinh khối tế bào thực vật có nhiều ưu
điểm như không chịu tác động của các yếu tố tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ
nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai, yếu tố thời vụ…. nên có thể chủ động được nguồn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

nguyên liệu phục vụ sản xất, thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh
khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên, chất lượng sản phẩm ổn
định do các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát chặt chẽ, có thể điều khiển quá trình
sinh tổng hợp tạo ra các hoạt chất cao hơn so với nuôi trồng tự nhiên bằng cách bổ
sung các chất kích thích tăng tích lũy các hoạt chất chính. Có thể sản xuất các hợp
chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng khác nhau.
Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định, khả
năng nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đạt hiệu suất tối đa cho sự tích
lũy và sản xuất các chất thứ cấp. Điều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các

học, vật lý như thành phần môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi
cấy, sự thông khí, lắc khuấy, ánh sáng, … đều ảnh hưởng lớn tới hàm lượng và chất
lượng các hợp chất thứ cấp.
Xuất phát từ thực tế trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khảo
sát ñiều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes ở sâm Ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv)”.
1.2. Mục ñích
Xác định khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh và điều kiện chuyển gen
thích hợp cho tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở sâm Ngọc
Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv).
Bước đầu xác định môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm
Ngọc Linh.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng chuyển được gen vào cây sâm
Ngọc Linh tạo rễ tơ thu sinh khối. Đồng thời, các thông số kĩ thuật đã xác định được sẽ
làm cơ sở cho việc chuyển các gen mong muốn vào cây sâm Ngọc Linh.
• Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở thúc đẩy ứng dụng công nghệ mới nuôi
cấy rễ tơ thu các hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp, dược phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây sâm Ngọc Linh
1.1.1. Phân loài
Sâm Ngọc Linh (danh pháp hai phần: Panax Vietnamensis) là một loài cây

chét, lá mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc nhọn, đầu
vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống lá chét ngắn dưới 1 cm, có lông ở cả hai
mặt, gân phụ 10 cặp hình lông chim, gân nhỏ hình mạng.
Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường tán đơn, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa
dài 15 - 30 cm. Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1 - 1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc,
hình tam giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1
ô, đầu nhụy chẻ đôi. Mùa hoa thường từ tháng tư đến tháng bảy, cây trồng từ hạt
thường sau 3 năm ra hoa.
Quả mọng, hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 - 1 cm, khi non
màu xanh nhạt, lớn dần có màu xanh đậm, khi chín màu đỏ, có chấm đen. Hạt hình
thận gần tròn, đường kính 2 - 3 mm, dài 3 - 4 mm, màu trắng xám. Số quả trên cây
dao động từ 5 - 40 quả, bình quân 6 - 7 quả trên cây. Mùa quả vào khoảng tháng
chín đến tháng mười (Nguyễn Tập, 2006).

Hình 1.2. Một số ñặc ñiểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

1.1.3. ðặc ñiểm sinh thái
Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành đám nhỏ
dưới tán rừng kín thường xanh ở độ cao từ 1,200 - 2,300 m. Nhiệt độ trung bình từ
15 - 18
o
C, độ ẩm 90%, lượng mưa hàng năm khoảng 3000 mm, đất nhiều mùn,
giàu chất dinh dưỡng.
1.1.4. Sinh trưởng
Hạt nảy mầm vào giữa tháng 12 đến tháng 2 năm sau. Cây ra hoa kết quả vào
tháng 4 - 6. Từ tháng 7 - 9 là thời kỳ quả chín có thể kéo dài đến tháng 10. Sau đó là
giai đoạn thân khí sinh tàn lụi, gọi là thời kỳ ngủ đông vào tháng 11, đến tháng 3

(Nguyen MD et al., 1993, 1994).
Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít
saponin nhóm olean. Thành phần saponin của sâm Ngọc Linh rất giống với thành
phần của các loài sâm trồng khác (Bảng 1.1). Nó chứa hầu như đầy đủ các saponin
chủ yếu có trong các loài sâm trồng như ginsenosid-Rb
1
, -Rd, - Re, -Rg
1
, và
notoginsenosid-R1, nhưng hàm lượng saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh lại cao
hơn, ngoài ra sâm Ngọc Linh chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh
ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (khoảng 5% và chiếm nửa lượng
saponin toàn phần). Thành phần đặc biệt này đã giúp sâm Ngọc Linh trở thành một
loài Panax độc đáo không những về mặt hoá phân loại mà còn về mặt dược lý
(Nguyen MD et al., 1993, 1994).
Bảng 1.1. Hàm lượng saponin (%) của sâm Việt Nam và các loài Panax trồng
trọt. (ppd: protopanaxadiol; ppt: protopanaxatriol)
Loại aglycon P. ginseng

P. notoginseng

P. uinquefolium

P. Vietnamensis
20(S)-ppd 2.9 2.1 2.7 3.1
20(S)-ppt 0.6 2.4 1.2 2.0
Ocotillol 0.04 5.6
Oleanolic acid 0.02 0.07 0.09
Tổng số(%) 3.5 4.5 4.0 10.8
Trong sâm Ngọc Linh còn có 17 axít béo có từ 8 - 20 cacbon, trong đó chiếm

có tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương, có tác dụng chống stress, tăng lực,
chống oxy hóa, phụ hồi sức khỏe. Khi thử nghiệm trên thần kinh trung ương ở liều
thấp 60 mg/kg và 120 mg/kg cao lá sâm Ngọc Linh có tác động rút ngắn thời gian
ngủ của pentobarbital và ở liều cao là 1800 mg/kg có tác dụng ức chế thần kinh
trung ương, kéo dài thời gian ngủ của pentobarbital. Cao lá sâm Ngọc Linh ở liều
600 - 1200 mg/kg đều thể hiện tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi
stress, đưa trở về trạng thái bình thường. Saponin toàn phần lá sâm Ngọc Linh có
tác động chống stress thể hiện rõ ở liều 2000 mg/kg. Hợp chất notoginsenoside-Fc,
một saponin có hàm lượng cao trong lá sâm Ngọc Linh, là hợp chất quyết định tác
dụng chống trầm cảm của cao lá sâm Ngọc Linh. Cao lá sâm Ngọc Linh có tác dụng
chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA. Ở thử nghiệm dùng cao lá sâm Ngọc
Linh cho thấy có tác dụng phục hồi sinh lực, giữ nguyên thời gian vận động của
động vật thí nghiệm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

1.1.7. Tình hình nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh
Cây sâm Ngọc Linh được biết đến khá muộn so với các loài sâm khác trên thế
giới, ngay khi loài sâm này được các nhà khoa học phát hiện thì việc nghiên cứu về
thành phần hóa học và giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh đã được tiến hành.
Năm 1974, Nguyễn Thới Nhâm tiến hành nghiên cứu bước đầu về thành phần
hóa học sâm Ngọc Linh, khi so sánh với sâm Hàn Quốc và tam thất Trung Quốc qua
sắc ký đồ cho thấy sâm Ngọc Linh có thành phần hóa học rất giống sâm Hàn Quốc.
Năm 1978, bộ y tế thành lập đơn vị nghiên cứu chuyên đề sâm K5 để điều tra nguồn
gốc sinh thái, trữ lượng và khoanh vùng bảo vệ. Đến năm 1980 đã tìm thấy được 108
vùng sâm mọc tập trung với trữ lượng lớn và độ tuổi rất cao (10 - 70 tuổi chiếm 70%).
Năm 1985, Hà Thị Dụng đã mang tiêu bản sâm Ngọc Linh sang Liên Xô để
phân loại và chính thức công bố trên toàn thế giới sâm Ngọc Linh là một loài mới
và đặc hữu với tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Rg1 và majonoside-R2, riêng sinh khối rễ còn có ginsenoside-Rb1.
Khi xác định hàm lượng saponin và dư lượng chất điều hòa sinh trưởng trong
callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh qua kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng và
định lượng bằng HPLC, dựa trên sự đối chiếu 3 chất chuẩn có được và so sánh với
sâm Ngọc Linh tự nhiên cho thấy đều có sự hiện diện của ginsenoside và
majonoside R2 với tỷ lệ và hàm lượng khác nhau. Ở mô sẹo hàm lượng MR
2
, G-
Rb
1
và GRg
1
thấp nhất, tiếp đến là mô sẹo biệt hóa rễ, mô sẹo biệt hóa chồi có hàm
lượng 3 chất trên cao nhất. Cũng sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC
đã xác định được dư lượng NAA và BA trong sinh khối sâm Ngọc Linh nuôi cấy in
vitro kết quả không thấy xuất hiện vạch của NAA và BA trong các mẫu phân tích
(Dương Tấn Nhựt và cs., 2010).
Theo nghiên cứu của tác giả Hoàng Xuân Chiến và cs. (2011) khi tạo củ sâm
Ngọc Linh in vitro và xác định hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử
nghiệm ở núi Ngọc Linh thì môi trường thích hợp nhất để tạo củ sâm Ngọc Linh in
vitro là SH có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16
giờ/ngày, nồng độ ABA thích hợp cho quá trình tạo củ là 3 mg/l, nồng độ sucrose
tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l, qua hệ thống HPLC cho thấy trong sâm Ngọc
Linh nuôi cấy mô trồng thử nghiệm 17 tháng tại núi Ngọc Linh có chứa 3 loại
saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh là MR
2
(0,77%)
,
G-Rg
1

tích lũy saponin của cây sâm Ngọc Linh in vitro của tác giả Hoàng Văn Cương và
cs. (2012) cho thấy kết hợp ánh sáng xanh và đỏ với tỷ lệ 50:50 thích hợp cho sinh
trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh in vitro. Các cây nuôi dưới ánh sáng
huỳnh quang cho sự tích lũy saponin cao nhất.
Dương Tấn Nhựt và cs. (2012) đã bước đầu đánh giá ảnh hưởng của methyl
jasmonate acid lên khả năng tích lũy saponin trong mô sẹo sâm Ngọc Linh và khảo
sát một số hệ thống nuôi cấy trong nuôi cấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc
Linh có nguồn gốc từ mô sẹo lên khả năng tạo saponin. Kết quả cho thấy rễ bất
định hình thành tốt nhất trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc chứa 2 lít môi trường
SH có bổ sung 3 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, trong đó rễ hình thành chứa được cả 3
loại saponin quan trọng MR
2
, G-Rb
1
, G-Rg
1
.
Trần Quang Trung và cs. (2013) đã xác định hàm lượng của 3 ginsenoside
Rb
1
, Re, Rg
1
trong sâm Ngọc Linh tự nhiên lần lượt là 1,0916%, 0,1226%,
1,4215%, trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần lượt là 0,3281%, 0,0817% và
0,3646%.
Gần đây nhất là nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Hiền và cs. (2014) đã tạo được
phôi trực tiếp từ lá, cuống lá, thân rễ cây sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ
sung 2mg/l NAA cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất.
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về tác
dụng dược lý của sâm Ngọc Linh, thành phần môi trường, thành phần hóa học trong

plasmid này chứa vùng T-DNA và vùng vir. Plasmid này có thể chuyển được vào
trong tế bào vi khuẩn A. Tumefaciens và cho phép chuyển đoạn T-DNA vào thực
vật (Hoekema et al., 1983).
Cây chuyển gen đầu tiên thu được vào năm 1983, điều này cho thấy rằng mới
chỉ hơn hai thập niên các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào
đã giúp ích rất nhiều cho các nhà chọn giống thực vật (Trần Quốc Dung, 2006).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

Năm 1984, thành công trong chuyển gen vào tế bào cây một lá mầm, mở ra
một tiềm năng mới trong chuyển gen vào tế bào thực vật một lá mầm nhờ
Agrobacterium ( Hooykaas et al., 1984).
Kể từ năm 1984, bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có
những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô,
lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải Các
gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá
hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới,
gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt cỏ (Trần Quốc Dung, 2006).
Năm 1985, Nicola đã phát hiện ra yếu tố trung gian trong việc truyền DNA từ
A. tumefaciens vào trong tế bào thực vật là các plasmid dạng vòng, đoạn DNA
được chuyển vào trong tế bào thực vật là đoạn T-DNA có kích thước 25kb (Nicola
et al., 1985). Cùng năm này Stachel đã phát hiện ra sự có mặt của acetosyringone
(AS) và alpha-hydrocyacetosyringone (OH-AS) tại vùng tổn thương của tế bào
thực vật giúp các vi khuẩn Agrobacterium nhận biết được các tế bào thực vật trong
tự nhiên (Stachel et al., 1985).
Từ đó đến nay các nhà khoa học đã đạt được nhiều thành tựu trong lĩnh vực
chuyển gen tạo ra thực vật kháng virus, cây có gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn
trùng Một số cây trồng chuyển gen thành công nhờ vi khuẩn Agrobacterium như cà
chua có chứa gen Bt chống được nhiều loài côn trùng cánh vảy Lepidoptera, cà chua

- Chuyển gen nhờ virus.
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
1.3. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm
1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả
năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành
một trong những công cụ quan trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với
những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực
vật thấp (khoảng 1 - 2 bản sao, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do
vậy giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển
gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh được sự hình thành của các cây
chuyển gen khảm, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

Phương pháp chuyển gen này đã được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng
cây trồng đặc biệt là trên cây hai lá mầm (khoai tây, cà chua, thuốc lá, đu đủ, ). Sự
chuyển gen vào cây một lá mầm khó thành công. Gần đây đã chuyển gen nhờ
Agrobacterium ở một số cây hòa thảo: lúa, ngô thành công. Trong trường hợp này
người ta thường dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp, môi
trường nuôi cấy có bổ sung acetosyringone (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí, xâm
nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn nay gây bệnh u rễ hay bệnh rễ tơ.
Agrobacterium thuộc: Giới Bacteria
Nghành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales