BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN
IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO
MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN
IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO
MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)
Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm
Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm vào việc nghiên cứu và hoàn thành
luận văn.
Tất cả các bạn đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẻ và động viên trong thời
gian làm luận văn, trong công việc và trong cuộc sống.
Tạ Thị Diễm Thu


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX ................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm .......................................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố ............................................................................................................ 3
1.1.3. Phân loại .......................................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học .......................................................................................... 6
1.1.5. Tác dụng chính của sâm .................................................................................. 6
1.2. SÂM NGỌC LINH ................................................................................................ 9
1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện ....................................................................... 9
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố ....................................................................... 10
1.2.3. Phân bố .......................................................................................................... 12
1.2.4. Thành phần hóa học chính ............................................................................. 12
1.2.5. Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh ........................................................... 18
1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (A. TUMEFACIENS)................................. 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 54
3.1. THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ .................................................................. 54
3.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro ................................ 54
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh
khối mô sẹo lá sâm ....................................................................................................... 55
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm ...........58
3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN ......................................................................... 66
3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen .......... 66
3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn A. tumefaciens ........ 68
3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển ..................................... 73
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................ 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 80
PHỤ LỤC
T
3

T
3

T
0

T3
0

T
0

T
0


EtBr:

Ethidium bromide

gus A:

Gen tạo enzyme β-D-glucuronidase

GUS:

Enzyme β-D-glucuronidase

hpt:

Gen tạo enzyme hygromycin phosphotransferase

HPT:

Enzyme hygromycin phosphotransferase

ipt:

Gen tạo enzyme isopentenyl transferase

IPT:

Enzyme isopentenyl transferase

kD:


Taq:

Thermus aquaticus

TDZ:

Thidiazuron

Ti:

Tumor-inducing

X-gluc:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

Vir:

Gen gây độc (Virulence)

R

R

R

R



Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen ...... 26
Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ. ......................................... 27
Hình 1.7. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. ............... 29
Hình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt................. 34
T
3

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin .......... 38
Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid
pVDH396 ................................................................................................................. 39
Hình 2.3. Vật liệu dùng nuôi cấy tạo mô sẹo .......................................................... 45
Hình 3.1. Mô sẹo của hai loại vật liệu dùng nghiên cứu sau 2 tháng nuôi cấy ....... 54
Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô
sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần.................................................................................. 56
Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1,
C2, C3, C4, C5 và C6 ............................................................................................... 60
Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi
trường C1, C2, C3 .................................................................................................... 61
Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi
trường C4, C5 và C6 ................................................................................................ 62
Hình 3.6. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo mảnh lá. .............. 63
Hình 3.7. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo cuống lá in vitro . 65


Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần ......................................................... 68
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 ................................... 69
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi
khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp .......................................... 70
Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen ....................................................................... 72
Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen ............................................ 74

R

R

associated receptor protein kinase); 4/ Có thể ứng dụng tác động của gen này như
yếu tố chọn lọc in vitro – thay thế tác nhân chọn lọc khác. Với ý nghĩa nêu trên,
nghiên cứu biến nạp gen ipt là vấn đề cần được quan tâm.
Đến nay trên thế giới cũng như ở trong nước chưa ghi nhận được công trình
công bố kết quả nghiên cứu về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng
trên đối tượng sâm Ngọc Linh.


2
Do vậy, đề tài “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl
transferase)vào mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”
được đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ
thuật biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen
chuyển ipt đến khả năng tăng sinh tổng hợp các chất thứ cấp.
Mục tiêu của đề tài
Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến
nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu
đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính
(thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Chưa nêu nội dung phân tích
hàm lượng hợp chất thứ cấp.


3



4
* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại,
rất hiếm, được tìm thấy ở phía đông dãy Himalaya.
* Panax japonicus C.A. Mey. (Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Japonicus
(Meyer) Hara): mọc hoang dại ở Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. maijor (Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng
(Panax pseudo-ginseng Wall var. maijor (Burk.) Li.): mọc hoang dại ở miền Nam
Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. angustifolius (Burk.) Chen et Chu: mọc
hoang ở miền Nam Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. bipinatifidus (Seem.) C.Y. Wu et K.M.
Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc.
* Panax zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung
Quốc.
* Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung
Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng và miền Bắc Việt Nam.
* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Himalaycus Hara: mọc hoang ở phái
Đông dãy Himalaya.
* Panax sp.: gồm mẫu C (thu hái ở Chame, Nepal) và mẫu G (thu hái ở
Ghorapani, Nepal): mọc hoang ở miền Trung Nepal.
* Panax vietnamensis Ha et Grushv.: mọc hoang và được trồng ở hai tỉnh Kon
Tum và Quảng Ngãi.
1.1.3. Phân loại
Đã có một số nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax. Và gần đây
nhất là hệ thống phân loại của Jun Wen (2001) thống kê 12 trong số 14 loài và dưới
loài của chi Panax đã được đề cập ở trên. [71]


5

Pseudoginseng

P.Pseudoginseng P. Pseudoginseng
Wall.
Wall.

Var.
Notoginseng
(Burk.) Hoo et
Tseng
Var. japonicus

Var.
Notoginseng
(Burk.) Chen

Var. Notoginseng
F.H. Chen

P. japonicus
C.A. Mey.

P. japonicus
C.A. Mey.

Subsp.
japonicus

Var.
Wanggianus

(Burk.) Li

P. Bipinnatifidus
Seem.
Var. Angustifolius
(Burk.) Jun
Wen

P.
Stipuleanatus
Tsai et Feng
P.
Zingiberensis
C.Y. Wu et
K.M. Feng

P. Stipuleanatus
Tsai et Feng
P. Zingiberensis
C.Y. Wu et K.M.
Feng
P. trifolius L.
P. Quinquefolius
P. Vietnamensis
Ha et Grushv.


6
1.1.4. Thành phần hóa học
Saponin và polyacetylen là hai nhóm hoạt chất chính có trong chi Panax.

dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư, sơ vữa động
mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não,… do có tác
dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể. [6], [53]


7
1.1.5.1. Tác dụng tăng lực, phục hồi sức [37], [90], [93]
Bột chiết sâm Triều Tiên và các ginsenosid chính như G-Rg1, G-Rb1 làm thay
đổi các thông số sinh hóa trong máu liên quan đến chuyển hóa năng lượng trong quá
trình vận động như làm tăng hàm lượng glucose, giảm hàm lượng glycogen trong
máu (do tăng dự trữ glycogen trong gan), giảm acid béo tự do, giảm hàm lượng
triglyceride, giảm hàm lượng acid lactic và acid pyruvic. Điều này cho thấy bột
chiết sâm Triều Tiên làm thay đổi cơ chế hằng định nội môi về năng lượng trong
quá trình vận động theo chiều hướng làm gia tăng khả năng sinh hóa của cơ xương,
oxy hóa acid béo tự do sản sinh năng lượng vận động thay cho glucose.
1.1.5.2. Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương
Sâm Triều Tiên thể hiện tác dụng lên hệ thần kinh theo hai hướng là kích thích
hoặc ức chế tùy theo thành phần ginsenosid và trạng thái bệnh lý. Takagi và cộng sự
đã chứng minh rằng các saponin thuộc nhóm protopanaxadiol mà tiêu biểu là GRb1 hoặc hỗn hợp saoponin có G-Rb1 và G-Rc thể hiện ức chế hệ thần kinh trung
ương, trong khi các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol, tiêu biểu là G-Rg1 và
những hợp chất tan trong lipid thể hiện tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương,
chống mệt mỏi. [37], [71], [81], [90]
Sâm Mỹ còn có tác dụng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, G-Rb1 và G-Rg1
đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng này. [127]
1.1.5.3. Tác dụng cải thiện trí nhớ
Bột chiết hồng sâm Triều Tiên có tác dụng cải thiện rõ khả năng học tập- ghi
nhớ do hoạt chất G-Rg1 quyết định, nhất là những tổn thương trong hoạt năng não
bộ liên quan đến tuổi già. [38], [69]
1.1.5.4. Tác dụng đáp ứng thích nghi và chống stress
Tác dụng dược lý quan trọng của sâm Triều Tiên là duy trì sự hằng định nội

1.1.5.9. Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp
Dịch chiết hồng sâm Triều Tiên (liều 200- 500mg/kg thể trọng) và các
ginsenosid chính như G-Rg1 và G-Rb1 có tác dụng cải thiện sự tuần hoàn máu gây


9
bởi nhiệt độ quá lạnh hoặc bởi norepinephrin, làm giảm suy tim thực nghiệm gây
bởi adriamycin. Bột hồng sâm 1,5-6g/ ngày x 2lần trong 3-24 tháng làm gia tăng sự
co bóp cơ tim, giãn mạch ngoại biên, cải thiện những thông số huyết động của tim,
rõ nhất là ở người cao tuổi. Ngoài ra, dịch chiết methanol của hồng sâm Triều Tiên
(liều 200mg/kg thể trọng) có tác dụng gia tăng tuần hoàn máu trong gan, lách, màng
nhày dạ dày, thận. [37], [57], [114]
* Ngoài những tác dụng chính trên, Nhân sâm còn có tác dụng hạ cholesterol
và lipid máu, giảm đau, giải độc, kích thích ăn ngon, làm sáng mắt, kéo dài tuổi thọ,
điều hòa nội tiết tố sinh dục,… [56], [114]
1.2. SÂM NGỌC LINH
1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện [5], [17], [132]
Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Ngọc Linh đã được
các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê
Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc
giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Sâm Ngọc Linh sống
trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Theo những thông tin
lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số của hai tỉnh này về một loại củ quý
hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người và do nhu cầu
của kháng chiến, ngành dược khu Trung Trung Bộ quyết phải tìm ra cây sâm chi
T
5

T
5

Ha et Grushv. Tên khoa học này do Hà Thị Dung và Grushvistky I. V.đặt, được
công bố nǎm 1985 tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô cũ).
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái [5], [6], [7], [17]
Sâm Ngọc Linh là cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm,
đôi khi trên 1m.
Thân rễ nạc, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40cm, có thể hơn, mang
nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài
màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ
còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa
chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại phát triển có
dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm
ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, có ba
dạng chính: dạng củ cà rốt, con quay và dạng bó củ.
Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2- 4 lá kép
chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 1014cm, rộng 3- 5cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng
nhỏ.
Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10- 20cm có thể
kèm 1- 4 tán phụ hay 1 hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán 60- 100 hoa,
cuống hoa ngắn 1- 1,5cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi
nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.
Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3- 5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá
chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.


11
Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau chuyển màu đen,
hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung
ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8- 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6cm, mỗi quả chứa
một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây khoảng 10 đến 30 quả.

loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau
cùng vào 1973. Đến 1985 được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến
nay sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh
Quảng Nam và Kon Tum.
Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’–
P

P

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’– 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc
P

P

P

P

P

P

Linh cao 2598m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ
cao khoảng 1500m- 2200m, chủ yếu tập trung ở 1800– 2000m, thuộc địa bàn của
hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng
như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. [17]
1.2.4. Thành phần hóa học chính
1.2.4.1. Hợp chất saponin
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm
Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran

2.859

6.059

Sâm 2 tuổi

0.979

0.426

1.235

1.868

4.236

Sâm 3 tuổi

0.846

0.678

1.419

2.409

5.352

Rễ củ 4 tuổi


4.166

9.474

1.518

1.778

2.432

2.946

8.674

1.565

0.981

1.652

4.276

8.494

2.716

0.840

3.648



2.7

3.1

20(S)–ppt

0.6

2.4

1.2

2.0

Ocotillol

–

–

0.04

5.6

Oleanolic acid

0.02

–

(I)

-H-

-Glc2-Rha

-Glc-

0.17

20-glc-G-Rf

(I)

-H-

-Glc2-Glc

-Glc-

0.01

G-Rg 1 *

(I)

-H-

-Glc2-Glc


(I)

-H-

-Glc-

-Glc6-

0.01

G-R 4

(I)

-Glc2-Glc

-H-

-Glc-

0.004

G-R 12

(K)

-H-

-Glc-


(K)

-H-

-Glc-

-Glc-

0.002

G-R 19

(L)

-Glc2-Glc

-H-

-Glc-

0.006

Tên
P

R

R

R


P

P

P

P

P

P

P

P

P

R

P

P

Hiệu suất (%)

Bảng 1.5. Acid Oleanolic [5]
Tên


R

P

P

P

P

Bảng 1.6. Ocotillol [5]
Kiểu

R1

R2

(M)

-Glc-

-CH 3

0.065

(M)

-Glc2-Rha

-CH 3


0.033

G-R 2

(M)

-Glc2-Xyl-Ac 4

-CH 3

0.014

Tên
PG-RT 4
R

24(s)-PGF 11

R

P

Hiệu suất (%)
R

P

R


P

R

P

R

R

R


15
G-R 6

(M)

Glc

-CH 3

0.006

G-R 14

(M)

-Glc2-Xyl


R

1.2.4.2. Hợp chất polyacetylen
Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với
panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu.
Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol. [16]
1.2.4.3. Thành phần acid béo
Bảng 1.7. Các axid béo được tìm thấy [5]
STT

Số carbon của hợp chất

%

1

8C

Vết

2

10 C

Vết

3

11 C


0.31

9

16 C

29.12

10

16 C1=

Vết

11

17 C

1.13

12

17 C1=

Vết

13

18 C


20 C

1.51

P

P

P

P

P

P

Tên

Acid palmitic