ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
• • • •

ũ

BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI
TÊN ĐÈ TÀI:“NGHIÊN c ứ u MÔI TRƯỜNG TỐI ư u ĐẺ SẢN XUẤT
SINH KHỐI VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM
NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỎNG”.
ĐÈ TÀI ĐẶC BIỆT CÁP ĐẠI HỌC QƯÓC GIA HÀ NỘI
MÃ SỔ: QG.06.14
CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI:
TS. Nguyễn Trung Thành
CÁC CÁN B ộ THAM GIA:
ThS. Nguyễn Kim Thanh
CN Nguyễn Anh Đức
ThS. Hà Tuấn Anh
ThS. Ngô Đức Phương
ThS. Lê Thanh Sơn
TS. Nguyễn Văn Kết
GS.TS. Paek Kee Yoeup
TS. Yu Kee Won
HÀ NỘI - 6/2008
ĐAI HOC QUỐC GIA HÀ NỘỈ
TPUNG TẦM ĩHÓNG TIN THƯ VIỆN
O QClhílC M O ị/l
MỤC LỤC
Trang
Danh mục các từ viết tắt III

Phụ lục 39
Tóm tắt các công trình nghiên cứu khoa học của cá nhân 40
Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ 43
II
DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẮT
TT
Ký hiệu viết tắt
Tên viết đầy đủ
1.
2,4D
2,4 dichlorophenoxy acetic axit
2.
BA
Benzyladenine
3.
IBA
Indole 3 butyric axit
4.
NAA
Naphthalene acetic axit
5.
MS
Murashige & Skoog
6.
TL tươi
Trọng lượng tươi
7.
TL khô
Trọng lượng khô
III

- Bước đầu phân tích và đánh giá thành phần, định lượng nhóm các
chât có hoat tính sinh hoc.
7. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Kết quả khoa học đã đạt được
1. Chất điều hòa sinh trường thực vật là nhân tố quan trọng trong nuôi
cấy tế bào và mô thực vật, ở đây auxin 2,4-D đã được sử dụng trong nghiên
cứu để tạo mô sẹo của Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha Et Grush). Kêt
quả thu được khi bổ sung 2,4-D vào môi trường răn MS ở nông độ 1 mg/L,
mô sẹo của Sâm Ngọc Linh được hình thành và phát triên tôt sau 28 ngày
nuôi cấy.
2. Trong nuôi cấy lỏng trên môi trường cơ bản MS thích hợp cho sự
sinh trưởng và phát triên của tê bào cũng như sự tông hợp sản phâm thứ câp
ginsenoside ở nồng độ thấp 0,5 - 1.
3. Trong môi trường MS có bổ sung các loại auxin (IBA và NAA) kết
quả sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy IBA là tối ưu cho sự sinh truởng và phát
triển của tế bào ở nồng độ 3 mg/L, sinh khối khô thu được 10.7 g/L và sản
phẩm ginsenosiđe (5.45 mg/g TL khô).
4. Cytokinin (BA và kinetin) đã được bổ sung khi kết hợp với 3 mg/L
IBA, kết quả cho thấy cytokinin đã ảnh hưởng không có nghĩa đến sự tăng
trưởng sinh khối khi tăng nồng độ từ 0,1 đến 1 mg/L, nhưng lại ảnh hưởng
đến sự tích lũy hàm lượng ginsenoside, hàm lượng ginsenside thu được ở
nồng độ 0,5 mg/L BA là 5.95 mg/g TL khô và ở nồng độ 0,5 mg/L kinetin
là 5.87 mg/g TL khô.
5. Nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tế bào cũng được thay
đổi, kết quả cho thấy 50 g/L là thích hợp cho sự tích luỹ sinh khối tế bào và
sự tổng hợp sản phẩm ginsenoside. Sinh khối khô tăng từ 5.4 đến 10.3 g/L
khi tăng nồng độ đường từ 0 đến 50 g/L. Tiếp tục tăng nồng độ đường sẽ
kìm hãm sự sinh trưởng tế bào cũng như sự tổng hợp ginsenoside.
6. Tương tự, ở nồng độ 30 mM nitrogen là tối ưu cho sự sinh trưởng tế
bào và sự tích lũy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ginsenoside.

3
SUMMARY REPORT
1. TITLE OF THE RESEARCH PROJECT
“Study on the suitable medium to culture the biomass cell and
ginsenosides production of Ngoe Linh Ginseng (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) by cell suspension cultures”.
2. CODE OF THE RESEARCH PROJECT
QG.06.14
3. PRINCIPAL RESEARCHER
Dr. Nguyen Trung Thanh
4. MAIN COLLABORATORS TO RESEARCH PROJECT
MSc. Nguyen Kim Thanh
BC. Nguyen Anh Due
MSc. Ha Tuan Anh
MSc. Ngo Due Phuong
MSc. Le Thanh Son
Dr. Nguyen Van Ket
Prof. Dr. Paek Kee Yoeup
Dr. Yu Kee Won
5. RESEARCH PROJECT OBJECTIVES
- The new method application to produce the biomass and useful
metabolite production of the medicinal plant in laboratory.
- Design a reseach way to produce the useful production in order to
care community health and the gene resource conservation.
- The research way is combinated by other speciality to study
(Botany, plant physiology and biochemistry, phamaceutical).
6. SKETCHES OF RESEARCH CONTENT
- Collect, isolate and selection sample ginseng with high bioactive
compound.
- Determination suitable medium to produce the biomass and useful

60 g/L seemed to repress the cell growth, further increase of sucrose
concentration upto 70 g/L led to a decrease in ginsenoside accumulation
and biomass production.
6. The maximum growth and ginsenoside production was obtained for
nitrogen concentration of 30 mM.
- The scientific articles and reports published and will being
published
+ 03 scientific articles were published on specialist journals
1. Nguyen Trung Thanh, Le Thanh Son and Paek Kee Yoeup. 2007
Induction and proliferation of callus of Ngoe Linh ginseng (Panax
5
'JW
vietnamensis Ha et Grushv): Effects of plant growth regulators. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23 (IS): pp. 167 - 173.
2. Nguyen Trung Thanh, Le Van Can and Paek Kee Yoeup. 2007.
The adventitious root cultures of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.). Proceeding of National Conference on Life Sciences 2007,
Science and Technical Publication House, Vietnam, pp. 828 - 831.
3. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup. 2007.
Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production
in cell suspension culture of Panax vieừiamensis Ha et Grushv. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23: pp. 269 - 274.
01 scientific report will being published on J. Science, VNU
4. Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup. 2008.
Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell
suspension culture of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.).
8. EXPENDITUDE AND SCHEDULE
- The project has been implemented on time (24 months).
- All budget (60.000.000 VND) have been fully received and

Paek và Cộng sự, 2001; Thành, 2005).
Sâm Ngọc Linh, còn gọi là Sâm K5 (Panax vỉetnamensis Ha et
Grushv) là loại Sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được đoàn điều tra dược liệu
Ban Dân y Khu V phát hiện năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai
tỉnh Kon Turn và Quảng Nam ở độ cao 1.500 - 2.300m. Do dược tính quý
7
giá của cây Sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ trong những năm
gần đây. Trong nhiều năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác
cây Sâm Ngọc Linh một cách ồ ạt vô tội vạ, không có kế hoạch bảo vệ, số
lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã đến mức báo động.
Trước tình hình như vậy, một dự án "Nghiên cứu hoàn thiện công
nghệ sản xuất giống, kỳ thuật và quy hoạch phát triển cây sâm K5 tại Kon
Tum" có sự hỗ trợ của 2 cơ quan: 1. Viện Dược liệu Bộ Y tế; 2. Trung tâm
Nghiên cứu Trồng chế biến Cây thuốc Hà Nội đã và đang được thực thi cho
đến nay. Ngoài ra, cho đến nay cũng đã có một số kết quả báo cáo về phân
tích thành phần saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Tanaka 1989; Hường và
Cộng sự, 1996; Đức và Cộng sự, 1997; Konoshima và Cộng sự, 1998;
Yamasaki, 1999).
Như vậy có thể nói rằng, những hiểu biết về cây Sâm Ngọc Linh đến
nay là rất khiêm tốn, và đặc biệt là trong vấn đề sản xuất sinh khối ở quy
mô lớn là còn đang hạn chế. Do đó cần nhiều những nghiên cứu chi tiết
cũng như khả năng ứng dụng của cây dược liệu quý giá này. Chính vì vậy
chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu này với đề tài: “Nghiên cứu môi
trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học
của Sâm Ngọc Linh (Panax vỉetnamensis Ha et Grushv.) bằng phương
pháp nuôi cấy lỏng”.
• MỤC TIÊU NGHIÊN CỬU
- Áp dụng một phương pháp tạo sinh khối một loài cây thuốc quý
ngay trong phòng thí nghiệm mà hiện nay chưa được áp dụng ở Việt Nam.
- Xây dựng một hướng nghiên cứu mới để tạo ra sản phẩm hữu ích

năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác một cách ồ ạt vô tội
vạ, không có ké hoạch bảo vệ, số lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã
đến mức báo động.
Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chúng đã
tăng nhanh theo thời gian trên toàn thế giới. Nhưng để thu hoạch được rễ
sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thì phải mất từ 4-6 năm và
nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lên rất cao (Person
1995). Ngoài ra việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc
trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng (Yu and Ohh, 1995). Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành
10
công trong sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các
nguyên liệu thô trong dược phẩm, các sắc tố và các hợp chất khác
(Bourgand, 2001). Sản phẩm ginsenosides thu được nhiều kết quả thật đáng
tự hào thông qua nuôi cấy tế bào thực vật (Lee và Cộng sự, 1995; Person,
1995; Thanh và Cộng sự, 2005)
Chất điều hòa sinh truởng thực vật được coi là một trong những nhân
tố quan trọng và quyết định sự thành công trong sự sinh trưởng, biệt hóa và
tổng hợp sản phẩm trao đổi thứ cấp của tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào
thực vật (Rokem và Goldberg, 1985). Nhiều bài báo nói về sự ảnh hưởng
của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro Panax
ginseng, từ nghiên cứu rất sớm (Kita va Sugii, 1969) đã chỉ ra trong nuôi
cấy mô Panax ginseng thì hooc môn 2,4D là nhân tố rất quan trọng.
Pisetskaya, (1970) đã tìm thấy vai trò của NAA và kinetin trong nuôi cấy
mô lá và rễ p. ginseng. Khi nghiên cửu ảnh hưởng của 2,4D và kinetin lên
sự tích lũy sản phẩm saponin trong nuôi cấy Panax ginseng (Kim và Cộng
sự, 1980) đã tìm thấy sự tổng hợp sản phẩm saponin tăng lên khi có sự kết
hợp của 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật (2,4D và kinetin). Aitsu và
Cộng sự, (1992) đã chứng minh rằng, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi
cấy sẽ kích thích sự tổng hợp saponin.

- Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sự tăng trưởng sinh khối
và sản phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ BA và kinetin kết hợp với IBA lên sự tăng
trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự tăng trưởng sinh khối và sản
phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự tăng trưởng sinh khối và sản
phẩm ginsenosides.
2.3. Nuôi cấy rễ bất định
Rễ bất định đã hình thành từ mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS bô sung 30 g/L đường sucrose, 10 g/L agar (Công ty sản xuất đồ
hộp Quảng Ninh). Hai loại auxin được sử dụng trong thí nghiệm để tạo ra rễ
bất định IBA và NAA với nồng độ 0, 1, 2, 4, 6 mg/L.
13
2.4. Chiết xuất và xác định hàm lượng ginsenosides
Rễ bất định đã thu hoạch, sửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60°c trong
7 giờ. Quá trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosides có trong rễ
sâm đã tiến hành theo mô tả (Furuya và cộng sự, 1983; Thành và cộng sự
2005). Các bước được thể hiện qua (Hình 2).
Material (1-2 g dry wt.)
ị extract 2 times with 50 mL of 75% MeOH
Ginseng extract
ị
evaporate the methanol and dissolve
in 50 mL water
Water so:
ution
partitioning twice with ethyl ether
Ether layer Aqueous layer
extract 3 times using

Cây thảo sống nhiều năm có thể cao 0,6 - lm, có thân rễ phát triển.
Thân rễ nạc đường kính 2-3cm (3,5cm), không có rễ phụ dày dữ trữ, đôi khi
cuối thân rễ có rễ củ to hình cầu, hình cong đường kính 5cm. Trên thân rễ
mang nhiều vết sẹo tròn, dấu vết thân khí sinh của các mùa sinh trưởng để
lại. Thân khí sinh nhẵn cao 40-60cm (lm ). Lá kép hình chân vịt mọc vòng,
thường có từ 3-4 lá kép (ít khi 5, 6): mồi lá kép thường có 5 lá chét. Lá chét
có hình trứng ngược hay hình mũi mác, mép lá có răng cưa, có lông cứng ở
cả hai mặt (3mm). Cụm hoa: thường là tán đon dài 15-25cm (dài gấp 1 5-2
15
lần chiều dài cuống lá kép). Tán hoa có đường kính 2,5-4cm có thể mang từ
50-120 hoa. Cuống hoa dài l-l,5cm. Hoa màu lục nhạt, đường kính khi hoa
nở 3-4mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông trên chia thành 5 răng nhỏ
hình tam giác cao l-l,5mm, năm cánh hoa màu lục nhạt; chỉ nhị trắng,
mảnh dài l,5-2mm. Bao phấn xoan, dính lưng. Đế hoa hơi lồi. Bầu 1 ô, từ
1-2 vòi.
Quả mọng khi chín có màu đỏ tươi, thường có chấm đen không đều ở
đỉnh quả, quả có từ 1-2 hạt có hình thận hoặc cầu dẹt. Hạt có màu trắng hay
vàng nhạt, bề mặt hạt ráp, có nhiều chỗ lồi lõm.
Chu kỳ sinh sản, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và địa hình khác
nhau. Nên có thể xác định chu kỳ sinh trưởng hàng năm như sau.
- Từ tháng 10 đến thàng 12: thân khí sinh của năm trước bắt đầu tàn
lụi, chồi mầm các bộ phận trên mặt đất bắt đầu hình thành.
- Từ tháng 1 đến tháng 3: xuất hiện và phát triển thân khí sinh và tán
hoa.
- Từ tháng 4 đến tháng 6: cây ra hoa và kết quả.
- Từ tháng 7 đến tháng 9: thời kỳ quả chín rộ.
1,3. Các thành phần hoạt chất chính có mặt trong rễ sâm Ngọc Linh
- Họp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu. Đã
xác định được cấu trúc protopanaxadiol II. Các saponin dammaran được
xem là hoạt chất quyết định như ginsenoside-Rbl, -Rb2, -Rb3, Rd đã được

4.
Arginin 46.6 10.
Valin
0.51
5.
Threonin
1.2 11.
Tyrosin
0.51
6. Serin
5.1 12. Phenylanin 0.51
Bảng 2. Thành phần các nguyên tổ vi, đa lượng
TT Nguyên tố vi đa
lượng
Hàm lương
(%)
TT
Nguyên tố vi đa
lượng
Hàm
lượng (%)
1.
Na
0.3 8.
p
0.3
2. Ca 0.3 9. Mn
0.05
3. Mg 0.5
10. Zn

gian khác nhau. Mầu được cắt thành từng miếng nhỏ có kích thước từ 0.2 -
0.5 cm và được cấy vào môi trường MS cơ bản để tạo mô sẹo. Sau thời gian
2 tuần nuôi cấy, chúng tôi đánh giá tỷ lệ nhiễm và sau 4 tuần đánh giá tỷ lệ
tạo mô sẹo, kết quả thu được ở Bảng 3.
Bảng 3. Tỷ lệ bị nhiệm và tỷ lệ tạo mô sẹo sau thòi gian khử trùng khác nhau
Thòi gian khử
trùng (phút)
rgì *» 1 A A ■ •
Tỷ lệ mâu bị
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống sót
và tạo mô sẹo (%)
Nhận xét
10
35 75
Số mẫu bị nhiễm nấm
khá nhiều, các mẫu
khác tạo mô sẹo tốt.
15 5 95
Số mẫu bị nhiễm nấm
không đáng kể, số còn
lại tạo mô sẹo tốt.
20
0 50
Tất cả các mẫu không bị
nhiễm nhưng khả năng
tạo mô sẹo kém, có biểu
hiện thâm nâu sau 2-3
tuần.
Sodium hypochlorite là một chất khử trùng, tẩy mạnh và độc đối với

9.6
Mô sẹo hình thành, về sau chuyển sang màu
xanh và dần dần trở nên rắn
1.0
13.5
Mô sẹo hình thành, phát triển tốt, có màu vàng
nhạt, xốp hơi bở
2.0
7.5
Mô sẹo hình thành, hơi rắn về sau chuyển
sang màu vàng, nâu
20
Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thì auxin được coi là nhân tố cần
thiết cho sự hình thành mô sẹo, tuy nhiên điều này cũng cho thấy nêu sử
dụng nồng độ không thích hợp thì sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự hình
thành mô sẹo. Đặc biệt ở các nồng độ auxin cao sẽ ức chế quá trình hình
thành mô sẹo, điều này đã được chứng minh khi nghiên cứu quá trình phát
sinh phôi của Picea abies và p. ginseng (Furuya, 1983; Bourgaud và cộng
sự 2001). Trong nuôi cấy p. ginseng, Son và cộng sự, (1999) cũng nhận
được kết quả tương tự với auxin 2,4D ở nồng độ 1.0 mg/L là tối ưu cho sự
hình thành ĨĨ
1
Ô sẹo. Furuya và cộng sự (1983) đã tình thấy rằng 2,4D là cần
thiết cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của p. ginseng, nhưng nồng độ
của 2,4D cao có thể gây ức chế sự sinh trưởng. Thí nghiệm này cho thấy
rằng 2,4D là auxin thích hợp cho sự hình thành và phát triển của mô sẹo.
Như vậy, kết quả thu được ở đây cho thấy nồng độ 1 mg/L 2,4D là tối ưu
cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh.
Hình 5. Quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định cùa sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis):
(A) củ sâm Ngọc Linh tươi thu từ núi Ngọc Linh; (B) mô sẹo hình thành ờ nồng độ 1 mg/L