14

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT
NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ SÂM
NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
LÀM VẬT LIỆU CHO NUÔI CẤY SINH KHỐI

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số:

62 42 01 12

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


24
Công trình được hoàn thành tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
và Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà

Tính cấp thiết của đề tài
Sâm ngọc linh là cây dược liệu quý và đặc hữu cho vùng sinh thái
nhất định. Thời gian sinh trưởng của cây chậm, cần tới 6 năm mới có
thể bắt đầu thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được củ sâm chất lượng tốt.
Trong khi đó, việc khai thác bừa bãi và không có phương pháp quản lý
hiệu quả đã dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu
cho các ngành dược liệu, mỹ phẩm,...
Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước
ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các
sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển. Tuy
nhiên, trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy.
Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn cho các nhà nghiên cứu, do
tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sinh khối tế bào
nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng.
Vấn đề này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ t ơ
vì rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không cần bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh
trưởng nhanh, phân nhánh cao; có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục và
không bị ảnh hưởng của dư lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay
các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Ngoài ra, rễ tơ có thể sản xuất một
lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên nuôi cấy rễ tơ
có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo. Xuất
phát từ các ưu điểm của rễ tơ và do những hợp chất dược liệu quý của
sâm ngọc linh chủ yếu thu được từ rễ nên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối”.
Mục tiêu của đề tài
Thu nhận được các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả năng

23 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên
quan đến luận án, 1 trang; Summary, 4 trang; Phần tài liệu tham khảo,
19 trang với 169 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. Luận
án có 31 bảng, 34 hình.


6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Những thành tựu nghiên cứu về cây sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.)
1.1.1. Giới thiệu về cây sâm ngọc linh
Cây sâm ngọc linh (hay sâm Việt Nam) có tên khoa học là Panax
vietnamensis Ha et Grushv. là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê
Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam.
Loài sâm này xuất hiện ở độ cao 1.500 m trở lên so với mực nước
biển. Từ 1.700 - 2.000 m, cây mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối,
có độ ẩm trên 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, dưới tán rừng hỗn giao giữa
lá rộng và lá kim.
Theo các nghiên cứu khoa học, sâm ngọc linh có tác dụng chống
trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư,
bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp ở người
bị huyết áp thấp,... Phân tích các hợp chất hóa học cho thấy sâm ngọc
linh có chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin),
trong đó có 26 saponin có cấu trúc đã biết.
1.1.2. Tình hình của loài sâm ngọc linh hiện nay
Sâm ngọc linh là loài sâm đặc hữu, chỉ sinh trưởng trong những vùng
sinh thái nhất định. Thêm vào đó là thời gian nuôi trồng sâm kéo dài,
thường cần tới 6 năm mới có thể thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được
củ sâm có chất lượng tốt, đã dẫn tới xảy ra tình trạng sâm bị khai thác
trộm trước thời gian được phép thu hoạch. Nhiều chương trình di thực

gồm 2 vùng chính là T-DNA và vùng vir (virulence).
Các chủng A. rhizogenes khác nhau cũng khác nhau về khả năng
chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào bộ gen thực vật và các rễ tơ do các
chủng khác nhau đó gây ra cũng biểu hiện các hình thái khác nhau (Giri
et al., 2001). Chủng A. rhizogenes thuộc dạng agropine là chủng có độc
tính mạnh, được đặc trưng bởi các Ri-plasmid: pRiA4, pRi1855 hoặc
pRiLBA9402 (Veena, Taylor, 2007), và các chủng này được sử dụng
chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật. Chúng có thể tích hợp
một cách độc lập hai vùng T-DNA riêng biệt vào hệ gen thực vật. Một
vùng mang các gen rol chịu trách nhiệm về các kiểu hình rễ tơ (gọi là
vùng biên trái, TL-DNA), trong khi đó, vùng còn lại mang gen aux1-2
mã hóa các enzyme kiểm soát sự tổng hợp auxin (gọi là vùng biên phải,
TR-DNA). TR-DNA đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình cảm ứng khởi tạo
rễ vì nó mang gen aux1-2, ngoài ra TR-DNA cũng mang gen mã hóa
tổng hợp opine. Trình tự của T L-DNA bao gồm 18 khung đọc mở
(ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 tương ứng mã hóa cho các
gen rolA, B, C và D. Các chủng A. rhizogenes khác bao gồm dạng
mannopine, cucumopine và mikimopine tương ứng với các Ri-plasmid


8
là pRi8196, pRi2659 và pRi1724, thì chứa vùng T-DNA đơn có cấu trúc
giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng
khuyết gen rolD, tuy nhiên chúng cũng có khả năng cảm ứng hình thành
các rễ tơ bởi các gen rol (Britton, Escobar, 2008).
1.2.2. Ứng dụng Agrobacterium rhizogenes trong nuôi cấy tạo rễ tơ để
thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật
Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn A. rhizogenes đã
được nghiên cứu rộng rãi để sản xuất in vitro các chất chuyển hóa thực
vật, hàm lượng chất chuyển hoá thu được tương tự hoặc cao hơn hàm

Mặt khác, elicitor cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các con
đường chuyển hóa phức tạp (Moreno et al., 1996), để mô tả sự tương tác
giữa các phản ứng stress sinh học và phi sinh học ở mức độ phân tử
(Atkinson, Urwin, 2012). Ngoài ra còn có các nghiên cứu đã được công
bố để đánh giá sự ảnh hưởng của elicitor tới enzyme trao đổi chất thứ
cấp (Zenk, 1991), các phân tử tín hiệu quan trọng làm trung gian của các
phản ứng kháng ở thực vật (Bux et al., 2012), nổ oxy hoá (Davis et al.,
1993), tín hiệu dẫn truyền phytoalexin (Preisig, 1994) và các kênh anion
(Zimmermann et al., 1998). Bên cạnh đó, elicitor có thể được sử dụng
để nghiên cứu các tính chất hóa học và con đường truyền tín hiệu của
các chất tự nhiên tiết ra bởi vi sinh vật, động vật ăn cỏ và thực vật trong
thời gian nhiễm bệnh, ăn cỏ, cộng sinh và tương tác allelopathic (Maffei
et al., 2012) .
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ bất định
là các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo của cây sâm ngọc linh nuôi cấy in
vitro.
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen là
các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo, phôi, rễ bất định của cây sâm ngọc
linh nuôi cấy in vitro.
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu nhân nhanh rễ
tơ và các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của elicitor tới khả tăng tích
luỹ hoạt chất saponin là dòng rễ tơ chuyển gen có khả năng sinh trưởng
nhanh và ổn định.
2.1.2. Các chủng vi khuẩn
Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 mang vector



chuyển gen
2.3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả
chuyển gen
2.3.2.6. Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh
trưởng phát triển của mô sâm ngọc linh
2.3.3. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen
2.3.3.1. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh
2.3.3.2. Đánh giá kết quả chuyển gen bằng phương pháp PCR
2.3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân
nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ pH của môi trường lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đặc và lỏng lắc lên
sự sinh trưởng của rễ tơ
2.3.5. Nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt
chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
2.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên khả năng
sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
2.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên khả năng sinh


12


13
sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho
thấy nguồn mẫu thích hợp nhất cho sự phát sinh mô sẹo là củ của sâm
ngọc linh (tỷ lệ tăng sinh đạt 9,71 lần).
3.1.2. Nuôi cấy thu nhận rễ bất định sâm ngọc linh
Các nguồn mẫu lá, cuống lá, củ và mô sẹo của sâm ngọc linh được
nuôi cấy trên môi trường SH có chứa 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8
và bổ sung thêm một trong ba loại auxin riêng lẻ (IAA, IBA, NAA) ở
các nồng độ khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mg/l.
Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy, nồng độ IAA, IBA,
NAA tối ưu nhất bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự tái sinh rễ bất
định lần lượt là 5 mg/l IAA; 5 mg/l IBA, 3 mg/l NAA. Trong 3 loại
auxin sử dụng, thì IBA (5 mg/l) cho hiệu quả tái sinh rễ cao nhất. Nguồn
mẫu thích hợp nhất cho sự tái sinh rễ bất định là mẫu lá với kích thước
1,5 x 1,5 cm.
3.2. Kết quả tối ưu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh
3.2.1. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen
Các mẫu mô sâm ngọc linh được lây nhiễm trong môi trường huyền
phù vi khuẩn với mật độ OD 600 = 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9. Thời gian lây
nhiễm là 20 phút. Sau đó các mảnh cấy được chuyển lên môi trường
đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành đánh giá
sự biểu hiện tạm thời của gen gus được biến nạp vào trong tế bào. Kết
quả thu được cho thấy, nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho chuyển gen
tạo rễ tơ sâm ngọc linh là OD600 = 0,5.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen
Các khoảng thời gian biến nạp khác nhau: 10, 20, 30 phút được
chúng tôi khảo sát. Kết quả thu được cho thấy, 20 phút là khoảng thời
gian biến nạp thích hợp nhất cho chuyển gen.
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả

trường SH + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 và có bổ sung các loại
kháng sinh riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau: vancomycin
(100 mg/l), carbenicilin (200, 400 mg/l), cefotaxime (250, 300, 500
mg/l). Đối chứng là môi trường không bổ sung kháng sinh. Kết quả thu
được cho thấy, cefotaxime với nồng độ 500 mg/l là thích hợp nhất cho
các thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh.
3.3. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen
3.3.1. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh


15
Dựa trên kết quả thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chuyển gen thông
qua vi khuẩn A.rhizogenes mang vector PTN289 ở nội dung 3.2, chúng
tôi đã tiến hành 8 lô thí nghiệm chuyển gen với chủng ATCC 15834
dạng dại, sử dụng vật liệu thực vật là mô sẹo.
Kết quả thu được cho thấy, các mô sẹo cảm ứng tạo rễ tơ sau 4 - 6
tuần chuyển gen. Tỷ lệ tạo rễ tơ trung bình của 8 lô thí nghiệm là
39,81%, trong đó tỷ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 45%
và thấp nhất là 33,75%.
3.3.2. Kết quả đánh giá các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR
Tỷ lệ mẫu dương tính với gen rolB và rolC ở các lô thí nghiệm đạt
được thấp nhất là 8,61% và cao nhất là 15%. Tỷ lệ mẫu mẫu dương
tính với gen rolB và rolC trung bình của cả 8 lô thí nghiệm là
11,90%.
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng
nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau lên khả năng sinh
trưởng của rễ tơ
Môi trường

9,00a
5,33b

2,00a
2,50a
2,80a
2,50a

*Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α ≤
0,05 trong phép thử Duncan

Môi trường khoáng thích hợp nhất là SH.
3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Độ pH
4,1

Khối lượng
tươi (mg)
44,00cd*

Khối lượng
khô (mg)
5,20e

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
3,33c

Chiều dài rễ

4,00bc
4,00bc

1,17c
2,20ab
2,90a
2,80a
1,70bc
1,30c

pH thích hợp cho sự sinh trưởng của các dòng rễ tơ là trong khoảng
từ 5,8 – 6,1.
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc
linh chuyển gen
Nhiệt độ
22°C
25°C
28°C

Khối lượng
tươi (mg)
74,30b*
102,30a
81,00b

Khối lượng
khô (mg)
8,10c
12,70a

41,70d
66,00c
81,33ab
86,33a
96,33a
70,30bc

Khối lượng
khô (mg)
4,00g
4,60f
7,10e
8,20c
9,30b
10,50a
7,60d

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
2,00b
2,67b
7,67a
8,33a
8,00a
9,00a
7,67a

Chiều dài
rễ (cm)
1,67c


khô (mg)
9,10a
8,00b
5,40c

(rễ/mẫu)
8,00a
4,67b
3,33b

rễ (cm)
2,93a
2,07b
1,80b

Agar là giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ.
3.4.6. Sự sinh trưởng của rễ tơ ở tổ hợp các điều kiện nuôi cấy tối ưu
trên môi trường đặc và môi trường lỏng lắc
Quan sát về mặt hình thái và tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ
trong thời gian cấy chuyền ở môi trường nhân nhanh tối ưu, chúng tôi
ghi nhận được sự phát triển mạnh nhất của 4 dòng rễ tơ có kiểu hình đặc
trưng như ở hình 3.1.

Hình 3.1: Hình thái của 4 dòng rễ tơ sâm ngọc linh điển hình sau 12 tuần nuôi cấy. a:
Dòng 1: rễ tơ dạng mảnh, phát triển theo chiều dài, phân nhánh chủ yếu ở dọc rễ chính;
b: Dòng 2: rễ tơ dạng nhỏ, phân nhánh nhiều, phát triển mạnh; c: Dòng 3: rễ tơ dạng
hình răng lược phân nhánh kém, phát triển chậm; d: Dòng 4: rễ tơ dạng sợi ngắn, phân
nhánh ít, phát triển chậm.


50
100
150
200
250

Khối lượng
tươi (mg)
247,33a*
203,33b
165,67c
137,33d
106,00e
82,67f

Khối lượng khô
(mg)
63,33a
43,00b
33,67c
29,33d
22,00e
19,33f

Đặc điểm rễ
Trắng
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
Vàng đậm

0,073269

4,633008
7,511306
7,332454
9,033344
3,771409
3,357971

Tổng saponin
chính (‰)
4,858135
7,864417
7,635159
9,744910
4,254538
3,805945

3.5.2. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ
saponin của rễ tơ
Tương tự như MeJA, khi bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy cũng
ức chế sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh, nhưng lại gia tăng khả
năng tích luỹ hoạt chất của rễ. Tại nghiệm thức 20 µl/l SA, tổng hàm
lượng saponin chính đạt được cao nhất và cao gấp 4,7 lần so với nghiệm


19
thức đối chứng (Bảng 3.9). Nếu xét về tốc độ sinh trưởng của rễ tơ tại
nghiệm thức 20 µl/l SA, thì khối lượng khô của rễ thu được tại nghiệm
thức này chỉ giảm 2,3 lần so với đối chứng (Bảng 3.8). Do đó, nếu tính


Đặc điểm rễ
Trắng
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
Vàng đậm

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ
Nồng độ
SA (µl/l)
0
10
20
30
40
50

Rg1 (‰)

Rb1 (‰)

MR2 (‰)

0,162560
0,282477
0,394336
0,886188
0,288974

Nồng độ ABA
(mg/l)
0
1

Khối lượng
tươi (mg)
247,33a*
217,00b

Khối lượng khô
(mg)
63,33a
51,67b

Đặc điểm rễ
Trắng
Trắng


20
2
3
4
5

195,67c
153,00d
113,33e
87,67f

0,061413

2
3
4
5

0,682291
0,392558
0,732950
0,265778

0,081027
0,033090
0,070097
0,061413

4,633008
22,27585
2
8,414319
8,452148
8,518925
3,727937

Tổng saponin
chính (‰)
4,858135
22,892046
9,177637

Bảng 3.12. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
và rễ bất định

0,3040
0,0140
0,2010
0,5010

Phần thân rễ
và rễ củ sâm
tự nhiên*
5,29
2,00
1,40
8,69

Rễ tơ/rễ
bất định
(lần)
0,97

557,40

415,20

-

1,34

2,7067

mạnh sau hơn 12 tuần nuôi cấy, ngược lại rễ bất định thì bắt đầu có hiện
tượng hoá nâu và ngừng tăng sinh. Mặt khác, quá trình nuôi cấy rễ bất
định cần thiết phải bổ sung auxin ngoại sinh (5 mg/l IBA), trong khi đó
rễ tơ có khả năng sinh trưởng trên môi trường không cần bổ sung chất
điều hoà sinh trưởng nên môi trường nuôi cấy rễ tơ không cần bổ sung
auxin. Điều này sẽ dẫn tới giảm đi lo ngại về tồn dư của chất điều hoà
sinh trưởng thực vật trong sinh khối rễ tơ sâm ngọc linh thu được. Do
vậy, rễ tơ là nguồn vật liệu thích hợp cho các nghiên cứu nuôi cấy thu
nhận sinh khối rễ bằng các hệ thống bioreactor, để tạo ra nguồn dược
phẩm sạch phục vụ sức khoẻ.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở
sâm ngọc linh
4.1.1. Mật độ vi khuẩn, thời gian biến nạp và thời gian đồng nuôi cấy


22
Park và Facchini (2000) báo cáo rằng chủng vi khuẩn và mật độ vi
khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả chuyển gen ở các cây dược
liệu. Mật độ tế bào vi khuẩn lớn khả năng xâm nhiễm mạnh, khả năng
chuyển gen cao. Ngược lại mật độ vi khuẩn thấp thì hiệu quả chuyển
gen thấp. Tương tự như vậy, khi thời gian lây nhiễm ngắn nồng độ
khuẩn xâm nhập vào mẫu biến nạp sẽ thấp dẫn đến tỷ lệ chuyển gen
thấp, thời gian lây nhiễm dài thì vi khuẩn có nhiều thời gian để xâm
nhập vào mô tế bào thực vật nên khả năng chuyển gen vào tế bào càng
lớn. Ngoài ra, đồng nuôi cấy cũng là giai đoạn để vi khuẩn xâm nhập và
chuyển đoạn T-DNA vào bộ gen của thực vật. Nếu thời gian đồng nuôi
cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể chưa xảy ra hoặc hiệu quả
biến nạp thấp, ngược lại thời gian đồng nuôi cấy dài thì vi khuẩn sẽ xâm
nhập vào mô nhiều làm khó diệt khuẩn dẫn tới mẫu dễ bị nhiễm lại và

Việc sử dụng kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn Agrobacterium
dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô thực vật nuôi cấy là
rất cần thiết. Tuy nhiên, bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy lại
làm chậm sinh trưởng và có thể gây độc mô và tế bào thực vật. Vì vậy
cần phải xác định được chất kháng sinh với nồng độ phù hợp, mà tại đó
mẫu mô thực vật không bị tổn thương nhiều mà kháng sinh vẫn có tác
dụng đối với vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, nồng độ kháng sinh thích
hợp là 500 mg/l cefotaxime.
4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các
dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
4.2.1. Hàm lượng khoáng
Các yếu tố khoáng đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hoà
sự sinh trưởng và sinh khối của rễ tơ (Sivakumar et al., 2005). Ở cây
sâm ngọc linh, các nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả
(2009, 2010a,b, 2012a,b) cũng chỉ ra rằng, môi trường SH được báo cáo
là thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các mô và cây sâm ngọc
linh. Vì vậy, ở thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường SH để
khảo sát hàm lượng khoáng. Kết quả thu nhận được cho thấy, không chỉ
có thành phần khoáng mới đóng vai trò quan trọng tới sự phát triển của
rễ tơ, mà tỷ lệ khoáng trong môi trường dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng
tới sự sinh trưởng của rễ.
4.2.2. pH
Giá trị pH của môi trường được đo dựa vào nồng độ ion H + trong môi
trường; pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường
khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào (Skirvin et al.,
1986). Giá trị pH của môi trường nuôi cấy thay đổi ảnh hưởng đến sự hấp
thu dinh dưỡng của tế bào nuôi cấy, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng
của tế bào (Nguyễn Quang Thạch et al., 2009). Kết quả của nghiên cứu này
cho thấy, rễ tơ sinh trưởng kém trong môi trường có pH được điều chỉnh


4.2.5. Giá thể nuôi cấy
Giá thể agar có chứa một số chất vô cơ như Ca, Mg, K, Na,… là các
yếu tố cần thiết cho sự tăng sinh rễ [Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy
Tiên, 2006]. Bên cạnh đó, môi trường thạch sử dụng agar có cấu trúc
xốp, thông thoáng khí lại tiết kiệm được chi phí. Vì vậy agar là giá thể
thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ.


25
4.3. Ảnh hưởng của một số chất kích thích (elicitor) lên khả năng
sinh trưởng và tích lũy hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ
chuyển gen sâm ngọc linh
Elicitor có thể được sử dụng như là một trong những công cụ quan
trọng để sản xuất các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học với năng
suất cao hơn và giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012).
MeJA, SA và ABA đều là những elicitor thuộc nhóm kích thích tăng
tích luỹ hoạt chất nhưng ức chế sinh trưởng, dó đó kết quả thu được
trong nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, cả ba loại elicitor này đều
không phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của rễ tơ sâm ngọc linh
chuyển gen; tuy nhiên, các loại elicitor này đều giúp gia tăng khả năng
tích lũy hoạt chất thứ cấp.
Mặt khác, mức độ ức chế sự sinh trưởng của rễ nuôi cấy cũng như
khả năng giúp tăng tích luỹ hoạt chất của ba elicitor này cũng khác
nhau. So với MeJA, thì SA và ABA có tác động mạnh mẽ hơn lên sự
tích lũy hoạt chất ở rễ tơ sâm ngọc linh. Ở nồng độ 20 µ/l SA và 1 mg/l
ABA, sự sinh trưởng của các mẫu rễ tuy có giảm nhưng không có hiện
tượng chết mẫu, khả năng tích lũy hoạt chất của rễ lại đạt cao nhất. Tính
toán hàm lượng saponin tổng số thu được trên toàn bộ sinh khối khô của
rễ tơ nuôi cấy, thì bổ sung 20 µ/l SA và 1 mg/l ABA vào môi trường
nuôi cấy giúp tăng khả năng tích luỹ hoạt chất lên tương ứng là 2 lần và