BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN QUỐC LÂM
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ
KHẲ NĂNG CHUYỂN HÓA XYLOSE THÀNH XYLITOL
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004)
Giáo viên hướng dẫn : TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi
Noi thực hiện : Viện Công Nghiệp-Thực Phẩm
Bộ môn Vi Sinh trường ĐH Dược
Hà Nội.
Thời gian thực hiện : Tháng 2/04-5/04.
HÀ NỘI, THÁNG 6-2004
/0 7.6^
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi
Là những thấy cô đã tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi làm khoá luận
này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ kỹ thuật viên Bộ môn Vi sinh-
Viện Công nghiệp Thực phẩn, Bộ môn Vi sinh - trường Đại Học Dược Hà Nội
và các phòng ban khác trong và ngoài trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả những người thân và bạn bè đã
động viên, khuyến khích và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi khi thực
hiện khoá luận này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2004
Sinh viên
Nguyễn Quốc Lâm
MỤC LỤC
Trang

2.3. Kết quả - bàn luận 23
2.3.1. Xác dịnh điều kiện thủy phân hemicellulose tối ưu 23
2.3.2. Phân lập và thuần khiết 24
2.3.3. Xác định khả năng sinh xylitol 28
2.3.4. Sơ bộ xác định đến tên chi các chủng phân lập cho test xylitol dương tính 34
Phần 3. Kết luận và Đề xuất 40
Tài liệu tham khảo 41
ĐẶT VÂN ĐỂ
Từ lâu xylitol được biết đến như một loại đường chức năng có nhiều
ứng dụng quan trọng trong Thực phẩm và Y-Dược. Một phần xylitol được tạo
ra trong cơ thể thông qua quá trình chuyển hóa các chất. Sự chuyển hóa xylitol
không phụ thuộc vào insulin, không gây tăng đường huyết ngay cả khi dùng
cho bệnh nhân tiểu đường, vì vậy người bị tiểu đường có thể sử dụng các chế
phẩm xyliyol mà không ảnh hưởng đến tình trạng bệnh như khi sử dụng các
đường khác. Hoạt chất này có khả năng chữa sâu răng, viêm tai giữa, nhờ khả
năng tăng pH miệng, trung hòa acid mảng bám, không bị vi khuẩn gây sâu
răng lên men và ngăn chặn khả năng phát triển của liên cầu khuẩn. Không chỉ
có vậy, xylitol còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như
dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và hàng tiêu dùng
Xylitol trên thị trường chủ yếu được tổng hợp bằng phương pháp hoá
học đã được áp dụng ở một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Đức Sản xuất
xylitol theo phương pháp này có giá thành cao vì qui trình sản xuất qua nhiều
công đoạn và tốn kém. Hiện nay, sản xuất xylitol thông qua chuyển hoá sinh
học các sản phẩm thuỷ phân hemicellulose là một xu thế được nhiều nhà sản
xuất quan tâm. Để góp phần vào hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đề
tài “ Phận lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển
hoá xylose thành xylitol “ với các mục tiêu:
> Xác định điều kiện tối ưu để thuỷ phân rơm, trấu cho nồng độ đường
khử cao.
> Phân lâp các chủng nấm men chuyển hóa xylose thành xylitol.

tính chất của xylitol được trình bày trong bảng 1.
2
Bảng 1. Một số tính chất của xylỉtol.
Tính chất
Xylitol
Công thức phân tử
c 5h 12o 5
Khối lượng phân tử
152,15
Mùi
Không mùi
Độ tan ở 20°c 169 g/lOOg H20
pH (lg/lOml H20)
5-7
Nhiệt độ chảy 93-94,5
Nhiệt độ sôi
216°c
Năng lượng
4,06 calo/g (16,88 J/g)
Tỷ trọng của dung
dịch (20°C)
10%
1,03
60%
1,23
Độ hấp thụ n
liệt
36,61 calo/g (153,76 J/g)
Độ nhớt của dung
dịch (20°C)/Ì

Hành 89
Xà lách
131
Cải hoa
300
Bí ngô
96,5
Xu hào
94
Cà
180
Tỏi tây
53
Thì là
92
Nấm
128
Hạt dẻ
14
1.2. ứng dụng của xylitol.
1.2.1. ứng dụng chung [15],[17],[18].
Xylitol là một polyol 5 cacbon có vị ngọt nhất trong số các polyol
nhưng lượng calo chỉ tương đương với glucose và thấp hơn nhiều so với
saccharose. Xylitol được dùng như một nguồn dinh dưỡng bổ trợ rất phù hợp.
4
Đã có những nghiên cứu đưa xylitol vào sử dụng trong các đồ ăn không
đường, kẹo cao su, sôcola, hoặc những kẹo có độ ngọt đậm. Đặc biệt xylitol
được sử dụng thay thế carbohydrate và alchohol trong các đồ ăn mà vẫn đảm
r*~
-

cách sử dụng các sản phẩm này, ta nên giữ cho xylitol được tiếp xúc lâu với
răng miệng. Đặc biệt với sản phẩm kẹo cao su 100% xylitol theo đường tổng
số, ta có thể sử dụng 4-5 lần/ngày, mỗi lần 1-2 cái sau bữa ăn chính, bữa ăn
nhẹ hoặc trước lúc đi ngủ kèm theo sử dụng nước súc miệng và trải răng
thường xuyên có khả năng điều trị sâu răng rất hiệu quả.
Theo các trắc nghiệm trên một số học sinh mắc bệnh sâu răng tại một
trường học cho thấy, nhóm 1 sử dụng kẹo cao su xylitol 65% mỗi ngày 4 ữ 5
lần, mỗi lần 5 phút, nhóm 2 sử dụng kẹo 15% và nhóm 3 không sử dụng kẹo
hay chế phẩm nào khác của xylitol. Kết quả hai nhóm sử dụng xylitol đã giảm
55% tình trạng bệnh so với nhóm không sử dụng. Nhóm 1 giảm bệnh hơn
nhóm 2 là 33%. Người ta tiếp tục trắc nghiêm một nhóm học sinh sử dụng kẹo
cao su xylitol và một nhóm khác sử dụng kẹo cao su có saccharose. Kết quả
đã chứng minh xylitol giảm 83% tình trạng bệnh, saccharose không có tác
dụng đối với bệnh sâu răng.
Một số xét nghiệm lâm sàng gần đây cho thấy liên cầu khuẩn gây sâu
răng có thể được truyền từ mẹ sang con qua một số tiếp xúc hàng ngày như
hôn, nhai mớm thức ăn Khi tiến hành thử nghiệm trên một nhóm bà mẹ sau
khi sinh sử dụng kẹo cao su xylitol từ 3-24 tháng và một nhóm khác sử dụng
chế phẩm của flour và chlohexidin trong 6, 12 và 18 tháng. Kết quả cho thấy
những đứa trẻ có mẹ sử dụng xylitol giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu răng từ 71-74%
so với nhóm sử dụng flour và chlohexidin. Từ đó họ đã khuyến cáo rằng để
giảm tỷ lệ mắc sâu răng ở trẻ em, các bà mẹ nên sử dụng kẹo cao su xylitol 4-
5 lần/ngày kết hợp với việc vệ sinh răng miệng cho cả mẹ và con.
6
* Đối với bệnh đái tháo đường [8].
Qua nghiên cứu về quá trình chuyển hóa đã cho thấy xylitol là một chất
trung gian bình thường trong quá trình chuyển hóa glucid, được chuyển hóa
qua đường pentose phosphat và acid uronic. Lượng xylitol bên ngoài đưa vào
cơ thể chuyển hóa không phụ thuộc insulin và không làm tăng lượng đường
trong máu. Xylitol có hiệu lực cung cấp năng lượng kể cả trong trường hợp có

gặp phải khi sử dụng kháng sinh. Ngoài những ứng dụng điển hình trên, một
sổ tài liệu còn cho rằng xylitol có vai trò trong việc ngăn chặn sự phát triển
của Helicobacter pylori một trong các tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày,
ngăn ngừa bệnh loãng xương ở người già và phụ nữ thông qua quá trình tăng
cường hấp thu canxi ở thành ruột [16].
Năm 1891 nhà bác học Fischer đã phát hiện ra xylitol, đến nay hoạt
chất này được ứng dụng rất rộng rãi trong công tác điều trị bệnh. Tuy vậy việc
nghiên cứu 1TLỞ rộng ứng dụng của xylitol và tìm phương pháp tổng hợp cho
năng suất cao vẫn là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm.
1.3. Tình hình sản xuất xylitol.
Ngay từ khi biết đến xylitol và những ứng dụng của hoạt chất này người
ta đã tiến hành nghiên cứu, tổng hợp và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn. Hai
phương pháp được áp dụng rộng rãi để sản xuất xylitol là phương pháp hóa
tổng hợp và phương pháp sinh tổng hợp.
1.3.1. Phương pháp hóa tổng hợp [22].
Phương pháp hóa học tổng hợp xylitol được tiến hành trên nguyên tắc
khử hóa D-xylose hay dịch thủy phân hemicellulose giàu xylose. Quá trình
khử hóa được tiến hành trong nồi hấp ở điều kiện 135°c, xúc tác là hỗn hợp
Raney-nikel (hỗn hợp gồm 50% nhôm, 50% nikel được sử lý bằng natri
hydroxyd đặc nóng) thời gian thủy phân là 2,5 giờ.
8
Xylytol được kết tinh và tách khỏi dịch khử hóa, phần xylitol không kết tinh
được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng. Cột sắc ký sử dụng cao 1 m, đường
kính 0,94 m, nhựa trao đổi cation là sulíonat polystyren divinylbenzen được
gắn trên chất mang là canxi hoặc stronti. Kết quả chạy sắc ký ngoài xylitol
còn có một số đường khác như: manitol, arabitol, galactitol, sorbitol
+ H20
H+, 135°
H-
CHO

Arabitol 14,0
Xylitol 46,2
Manitol 0,3
Sorbitol 2,2
Xylitol kết tinh được tách khỏi dung dịch mẹ bằng máy ly tâm. Phương
pháp sắc ký được sử dụng để tập trung xylitol, người ta cho dung dịch mẹ
chạy qua cột sắc ký và thu lấy công đoạn chứa nồng độ xylitol cao. Sau nhiều
lần chạy sắc ký các phần dịch xylitol được gom lại để thu được dịch có nồng
độ xylitol khoảng 85%. Dung dịch tiếp đó được làm lạnh từ từ xuống khoảng
2-5°C để kết tinh xylitol. Sản phẩm xylitol thu được sẽ lẫn khoảng 5% xylose.
Dung dịchh sau khi tách xylitol kết tinh được tái chế để thu nốt phần xylitol
chưa kết tinh . Sản phẩm sẽ được tinh chế lại cho đến khi xylose chỉ còn dưới
0,1%.
Năm 1999 Heikkila đưa ra phương pháp tổng hợp xylitol từ acid
xylonic. Theo cách này acid xylonic được khử hóa ở 110°c với xúc tác
rutheni trong 3 giờ. Dịch khử hóa được lọc và cô đặc đến nồng độ xylitol
t khoảng 92% thì bắt đầu cho kết tinh. Xylitol kết tinh được tách bằng máy ly
tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong 5 phút. Năng suất của phương pháp này
đạt 0,297 g/g và độ tinh khiết của sản phẩm là 68%. Thành phần dich trước và
sau khử hoá dược trình bày trong bảng 4 [13].
10
Bảng 4. Nồng độ các chất sau khử hóa trong phương pháp sử dụng
acid xylonic
Tên chất Dịch trước khử hóa (%)
Dịch sau khử hóa (%)
Acid xylonic
94,2
8,3
Xylitol 0
75,9

smagematis bằng dung dịch D-xylose 2% theo phương pháp lẽn men động và 1
lên men tĩnh. Kết quả nồng độ xylitol thu được sau quá trình lên men động là
0,8% và quá trình lên men tĩnh là 1,4%. Năng suất của phương pháp đạt 74%
[19]. Năm 1997, Saha đã tìm ra một số chủng nấm men và nấm sợi sinh
enzym xylose reductase và có khả năng sinh tổng hợp xylitol. Một số loài nấm
men thuộc chi Candida được ứng dụng rộng rãi để sản xuất xylitol gồm:
Candida pelliculosa , Candida boidinii , Candida guilliermondii , Candida
tropicalis. Một số chi nấm men khác cũng được sử dụng sinh tổng hợp xylitol
là: Saccharomyces , Debaryomyces , Pichia , Hansenula , Trichosporon ,
Cryptococcus , Rhodotorula , Kluyveromyces , Pachysolen , Ambrosiozyma ,
Kloeckera Các chủng vi khuẩn ít được ứng dụng sinh tổng hợp xylitol hơn
so với các chủng nấm men, tuy nhiên một số chủng vi khuẩn như :
MDP+ x y litđ
D-xyỊiẩose
Hình 2. Sơ đồ chuyển hoá D-xylose thành xylitol.
chú thích. XR: enzym D-xylose reductase
12
Enterobacter liquỷaciens, Corinebacterium sp, Mycrobacterium smagenmatis
đã được Horitsu nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp xylitol vào năm
1992 [24].
Sử dụng vi sinh vật sing tổng hợp xylitol từ nguồn nguyên liệu xylose
trong công nghiệp rất quan trọng và ngày càng được nghiên cứu ứng dụng sâu
rộng, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới.
* Ảnh hưởng của nồng độ D-xylose và một sô' điều kiện khác đến quá trình
sinh tổng hợp xylitol.
Nồng độ xylose ban đầu có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
xylitol của vi sinh vật. Năm 1992, Horitsu đã nghiên cứu ảnh hưởng của các
nồng độ D-xylose khác nhau, từ 100 g/1 đến 300 g/1, đối với quá trình sản xuất
xylitol. Theo tác giả, nồng độ D-xylose tối ưu để sinh tổng hợp xylitol đối với
chủng Candida tropicalis là 172,0 g/1. Horitsu đã tiến hành lên men ở nồng

lý thuyết. Nồng độ xylitol thu được từ dịch thuỷ phân sau lên quá trình men
là 94,74 g/1 với nồng độ D-xylose trong dịch thuỷ phân trước khi lên men là
105,35 g/1 . Nghiên cứu được tiến hành nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp
xylitol của chủng này bằng sự thay đổi nồng độ D-xylose trong dịch thuỷ
phân bắt đầu từ nông độ thấp đến nồng độ cao cho đến khi tế bào nấm men
vẫn phát triển tốt và sinh tổng hợp xylitol cho hiệu suất cao. Năm 1995,
Roberto sử dụng dịch thỷ phân rơm có thêm amonisulíat ((NH4)2S04) và cám
thì chủng Candida guilliermondii đã đạt năng suất là 0,68 g/g với tốc độ sinh
xylitol là 0,54 g/l.h. Với chủng Candida sp 11-2, nguồn nguyên liệu sử dụng
là lõi ngô thì năng suất đạt 0,57 g/g và tốc độ sinh xylitol là 1,94 g/l.h [23].
Qua nghiên cứu, Hyroshi Onishi và Toshiyuki Suzuki đã xác định được năng
suất tổng hợp xylitol từ D-xylulose của một số chủng nấm men. Kết quả được
trình bày trong bảng 5 [12].
14
Bảng 5. Năng suất tổng hợp xylitol của một số chủng nấm men.
TT
Tên chủng
Năng xuất(%)
1
s. rouxii N28
33,3
2
s. rouxii E7
28,5
3
s. rouxii 3281
26,8
4
s. acidifaciens S9
16,6

14
Hansenula suaveolens
13,2
15
c. tropicalis
(ATCC 20216)
17,0
16
Pichia f'arinosa
(ATCC20218)
16,3
15
Với viêc sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng lên men D-xylose
hoặc dịch thỷ phân hemicellulose phương pháp sinh tổng hợp xylitol không
chỉ cho năng suất cao mà còn tận dụng đươc nguồn chất thải nông nghiệp vừa
tránh lãng phi vừa tránh gây ô nhiễm môi trường và giải quyết được vấn đề giá
thành trong các qui trình sản xuất trên qui mô lớn.
16
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu , thiết bị
2.1.1.Nguyên liệu, hoá chất
- Acid sulíuric (Trung quốc)
- Ethanol (Việt nam)
- Acid photphoric (Việt nam)
- Agar (Việt nam)
- Kalifericyanua (Việt nam)
- Amonisulíat (Trung quốc)
- Glucose (Việt nam)
- D-xylose (Đức)
- Kalihydroxid (Trung quốc)

LG
Electrolux
(Nhật)
(Nhật)
(Thụy Điển)
(Hàn Quốc)
17
-Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorí, ống Falcon, Pipetman,
đầu côn các loai, que cấy các loại
2.1.3. Môi trường.
* Các thành phần quan trọng dùng trong môi trường:
Mineral: (Dung dịch muối khoáng cơ bản).
k h 2p o 4 850 mg
k 2h p o 4
150 mg
MgS04.7H20 500 mg
NaCl 100 mg
CaCl2
100 mg
H20 vừa đủ
1000 ml
Ig dịch khoáng chất vi
lượng).
H3BO3
500 jug
CuS04.5H20
400 ụ\
KI
0
0

- Yeast extract (cao nấm men) 5 g
- (NH4)2S04 5 g
- Dịch thuỷ phân rơm (pH = 4,5 ) vừa đủ 1000 ml
* Môi trường được hấp thanh trùng ở 105°c trong 25phút.
Mỏi trường 3 : Môi trường thử test xylitol.
- Mineral 100 ml
- Trace 200 ụ 1
- (NH4)2S04 5 g
- Yeast extract (cao nấm men) 3 g
- D-xylose 75 g
- Nước cất vừa đủ 1000 ml
Chú Ý:
- Hấp riêng phần 1 (Mineral, Trace, (NH4)2S04, cao nấm men) và phần 2
(D-xylose) ở điều kiện 121°C/20 phút.
- Để nguội 70ữ80°c rồi trộn đều trong Box cấy vô trùng.
19
Mỏi trường 4 : Môi trường Malt-Glucose 2°Bx.
- Glucose
10 g
20 g
1000 ml
- Agar
- Nước Malt l°Bx
* Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121°c trong 20 phút để nguội
khoảng 60°c thì đặt thạch nghiêng, sấy trong tủ 45-50° c cho môi trường khô
(không còn hơi nước bám trên thành ống nghiệm).
2.2. Phưtpig pháp nghiên cứu.
2.2.1. Tìm điều kiện thuỷ phân hemicellulose.
Chúng tôi sử dùng dung dịch acid sulíuric để thủy phân hemicellulose
trong nguyên liệu là một số chất thải nông nghiệp như rơm, trấu. Dịch thuỷ

hành pha loãng mẫu trong ống íalcon có 5 ml nước cất đã hấp thanh trùng rồi
làm tương tự như các bước ở trên [2],[7].
2.2.3. Tuyển chọn và thuần khiết.
Khi các mẫu đã mọc sau 2-4 ngày, bằng nhận thức cảm quan và quan
sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học, chọn lấy các khuẩn lạc nấm men
riêng rẽ khác nhau dựa vào màu sắc, hình thái khuẩn lạc. Tiến hành thuần
khiết trên môi trường phân lập số 1 bằng cách dùng que cấy, cấy zic-zăc
nhiều lần trên bề mặt thạch cho đến khi thu được chủng thuần khiết. Sử dụng
môi trường số 1 giữ giống các chủng sau khi thuần khiết ở 5°c [2].
2.2.4. Nhân giống các chủng phân lập.
Sử dụng môi trường nhân giống số 2, chia vào các ống nghiệm sạch
2ml/ống bằng HandyStep. Dùng que cấy lấy một lượng tương tự tế bào các
chủng, cấy vào các ống nghiệm tương ứng với từng chủng. Nuôi cấy lắc để
21
tăng sinh khối ở nhiệt độ 28°c trong 5 ngày, lắc 150 vòng/phút với góc
nghiêng khoảng 65°.
2.2.5. Thử khả năng sinh xylỉtol.
Sau thời gian nuôi cấy với điều kiện như phần 2.2.4, đem ly tâm bỏ
dịch lấy tế bào. Dùng HandyStep cho vào mỗi ống nghiệm trên l,5ml môi
trường thử test số 3, nuôi cấy lắc với điều kiện tương tự như khi nhân giống.
Sau 5 ngày nuôi cấy quan sát sơ bộ khả năng mọc của các chủng, ghi sơ bộ
kết quả. Ly tâm lấy dịch cho vào các ống Eppendorí tương ứng.Tiến hành phá
huỷ enzym trong dịch thu được bằng máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 99°c trong
10 phút. Tiến hành thử khả năng chuyển hoá xylose thành xylitol bằng phương
pháp đo quang
2.2.6. Phương pháp định lượng xylitol.
* Nguyên tắc:
Trong đó PMS là phenazine methosulfate, INT là 2-(4-iodophenyl)-3-(4-
nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chlorid, XDH là enzym Xylitol
dehydrogenase được tách chiết từ chủng nấm men Candida tropicalis.