BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VỚI
VI KHUẨN GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA
PHÂN LẬP TẠI AN GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA NGUYỄN VĂN VINH
MSSV: 3102795

PHÂN LẬP TẠI AN GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA NGUYỄN VĂN VINH
MSSV: 3102795
LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. Nguyễn Đắc Khoa Nguyễn Văn Vinh

Nguyễn Văn Cà, bạn Nguyễn Hoàng Khuyên và em Phan Trần Khải đã nhiệt tình giúp
đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc
thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương
diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Cuối lời, xin chúc cha mẹ, quý thầy cô và các anh chị luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công trong mọi lĩnh vực.
Cần Thơ, ngày 27 tháng 10 năm 2013 Nguyễn Văn Vinh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
i

TÓM TẮT
Bệnh cháy bìa lá (bạc lá) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra
là một trong những bệnh nghiêm trọng trên ruộng lúa. Mục tiêu của đề tài là định danh
được 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng
mạnh với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà
lưới, tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh này. Quá trình định
danh vi khuẩn được thực hiện bằng cách kết hợp giữa phương pháp truyền thống sử dụng
Hệ thống phân loại Bergey và phương pháp hiện đại sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen
16S rRNA của vi khuẩn.
Chủng vi khuẩn NMCM2 là Bacillus stratophericus và chủng VTTS1 là Bacillus
safensis. Kết quả sử dụng Hệ thống phân loại Bergey cho thấy 2 chủng vi khuẩn NMCM2
và VTTS1 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, lài và bìa gợn sóng trên môi trường thạch dinh
dưỡng. Cả 2 là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh nội bào tử, sống riêng lẻ, có khả
năng di động và kích thước lần lượt là 0,7-0,9 x 1,2-2,7 µm và 0,5-0,7 x 1,0-1,2 µm. Các
chủng vi khuẩn này không thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính


DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

1.2. Mục tiêu đề tài

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Bệnh cháy bìa lá lúa

2.1.1. Lịch sử

2.1.2. Triệu chứng

2.1.3. Tác nhân gây bệnh

2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

2.2. Biện pháp phòng trừ bệnh

2.2.1. Biện pháp canh tác

2.2.2. Biện pháp sử dụng giống kháng

2.2.3. Biện pháp hóa học


3

4

6

7

8

8

8

9

9

11

11

11

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iii

2.3.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn


3.1.5. Hóa chất

3.2 Phương pháp

3.2.1. Phương pháp truyền thống-Hệ thống phân loại Bergey

3.2.1.1. Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

3.2.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

3.2.2. Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

3.2.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA

3.2.2.2. So sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả sử dụng hệ thống phân loại Bergey

15

19

19

20

21


27

28

28

32

34

34

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iv

4.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

4.3. Định danh vi khuẩn bằng cách kết hợp khảo sát các đặc tính sinh hóa với kết
quả giải trình tự gen 16S rRNA

4.3.1. Chủng vi khuẩn NMCM2

4.3.2. Chủng vi khuẩn VTTS1

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận


52

56

61

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
v

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.
Bảng 2.
Bảng 3.
Bảng 4.

Bảng 5.
Bảng 6.
Diện tích nhiễm cháy bìa lá lúa vụ Thu Đông qua 5 năm tại An Giang

Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng gắn huỳnh quang

Các đặc tính khác nhau giữa các nhóm vi khuẩn sinh nội bào tử trong
nhóm 18 của Hệ thống phân loại Bergey

Hình 2.
Hình 3.
Hình 4.
Hình 5.
Hình 6.

Hình 7.

Hình 8.

Hình 9.

Hình 10.Hình 11.Hình 12.

Hình 13.

Hình 14.Hình 15.Hình 16.



Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn VTTS1

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng
NMCM2 bằng công cụ Blastn trên NCBI

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng
VTTS1 bằng công cụ Blastn trên NCBI.

Vòng vô khuẩn được tạo ra do chủng NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh
ampicillin

6
6
15
16
34

35

35

36

38

38

40
41

46 48
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
viii

TỪ VIẾT TẮT
APHA American Public Health Association
ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long
ĐHCT Đại học Cần Thơ
FAO Food and Agriculture Organization
IRRI International Rice Research Institute
MR Methyl Red
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC&PT Nghiên cứu và phát triển
NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
PCR Polymerase Chain Reaction
RPM Revolutions per minute
VP Voges Proskauer

ĐBSCL là vùng sản xuất lúa lớn nhất cả nước, có sản lượng lúa đạt 24,6 triệu tấn
vào năm 2012, chiếm 56% sản lượng lúa cả nước (Sở NN&PTNT Vĩnh Long, 2012).
Điều kiện thời tiết ngày càng khắc nghiệt, nắng nóng mưa nhiều, đan xen nhiều cơn bão,
là điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh hại lúa phát triển. Trong đó, bệnh cháy bìa lá (bạc lá)
là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm nhất (Ezuka và Kaku, 2000). Từ những năm
1978, bệnh cháy bìa lá bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL làm thiệt hại năng suất
khoảng 40% (Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005).
An Giang có 262.286 ha canh tác lúa (Cục Thống kê An Giang, 2009), là một trong
những tỉnh sản xuất lúa gạo trọng điểm của cả nước. Trong các loại dịch hại, bệnh cháy
bìa lá xảy ra thường xuyên và trên diện tích lớn. Theo Nguyễn Trung Thành (2011), An
Giang đang đẩy mạnh sản xuất lúa thơm với các giống Jasmine 85, VD 20, OM4900…
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2

Các giống này thường là các giống nhiễm bệnh cháy bìa lá nặng nên đã gây ảnh hưởng
nhiều đến năng suất và chất lượng của hạt.
Đứng trước những thách thức về vấn đề an ninh lương thực, bên cạnh việc lai tạo ra
các giống lúa siêu năng suất hoặc có khả năng chịu mặn cao thì việc phòng trị cũng như
hạn chế tác hại của sâu bệnh hại lúa nói chung và bệnh cháy bìa lá nói riêng là một vấn đề
đang được quan tâm nghiên cứu. Theo Cao et al. (2003) và Lee et al. (2002), để kiểm soát
bệnh cháy bìa lá, thuốc hóa học và giống kháng là 2 biện pháp thường được nghiên cứu
và ứng dụng, tuy nhiên các biện pháp này chưa thu được kết quả cao và còn tồn tại nhiều
hạn chế. Chưa có thuốc đặc trị, bên cạnh đó sử dụng thuốc hóa học làm ô nhiễm môi
trường, tiêu diệt thiên địch, có thể làm cho vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc, lưu tồn thuốc
trên sản phẩm, bệnh bùng phát và gây hại trên diện rộng. Tuyển chọn và lai tạo giống
kháng tốn nhiều thời gian và kinh phí trong khi gen kháng dễ mất tác dụng sau một thời
gian triển khai ngoài đồng. Do vậy, phòng trừ sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng là
biện pháp có triển vọng để hạn chế bệnh cháy bìa lá, biện pháp này an toàn với sức khỏe
con người, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần quan trọng trong việc phát triển

Năm 1954, 90,000-150,000 ha ruộng lúa ở Nhật bị ảnh hưởng và thiệt hại 22,000-110,000
tấn. Tại Ấn Độ, bệnh được ghi nhận từ năm 1951 và đến năm 1963 bệnh bùng phát thành
dịch. Tại Philippines, thiệt hại vào mùa mưa lên đến 22,5%, thiệt hại vào mùa khô khoảng
7,2% đối với những giống mẫn cảm (Exconde, 1973).
Theo Phạm Văn Biên et al. (2003), bệnh đã gây hại ở Việt Nam từ lâu trên các giống
lúa mùa cũ; đặc biệt trong mùa mưa, bệnh cháy bìa lá là một trong những tác nhân gây ảnh
hưởng đến sản lượng lúa của Việt Nam. Những năm 1970-1975, bệnh cháy bìa lá đã gây
thành dịch hại rộng lớn ở các tỉnh Đồng bằng Sông Hồng trên giống lúa Trân Châu lùn và
các giống lúa mùa địa phương, trên giống NN8 mức độ nhiễm bệnh lên tới 60-100% làm
giảm năng suất từ 30-60%. Gần đây bệnh phổ biến trên một số giống lúa lai nhập nội. Bệnh
cháy bìa lá có chiều hướng gia tăng và trở thành một trong những bệnh gây ảnh hưởng
nghiêm trọng trong cả 2 vụ lúa ở miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004).
Bệnh cháy bìa lá cũng được ghi nhận bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL từ những
năm 1978 làm thiệt hại về năng suất khoảng 40%. Năm 1984, bệnh bùng phát thành dịch
trên 77.000 ha. Đến năm 1991-1992 bệnh tái phát ở các tỉnh Long An, Tiền Giang, Hậu
Giang Có khoảng 10.000 ha lúa IR50404 và OM269 bị thiệt hại, trên 200.000 ha trồng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4

các giống lúa khác bị nhiễm ở hầu hết các tỉnh ĐBSCL, mức thiệt hại khoảng 10-15%
(Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Theo Nguyễn Trung Thành (2011), bệnh cháy bìa lá lúa đã gây hại trong vụ Thu
Đông của tỉnh An Giang trong 5 năm liên tiếp từ 2006 đến 2010 với diện tích gần 42.000
ha, chiếm 10% tổng diện tích canh tác (Bảng 1). Trong đó, diện tích lúa Thu Đông nhiễm
bệnh cháy bìa lá tăng dần theo các năm.
Bảng 1. Diện tích nhiễm cháy bìa lá lúa vụ Thu Đông qua 5 năm tại An Giang
(Nguyễn Trung Thành, 2011)
Diện tích nhiễm (ha)
Vụ

7.345,0

58.849

12,48

Thu Đông 2008
5.180,0

322,2

12,2

5.514,4

94.421

5,84

Thu Đông 2009
11.233,7

1.263,0

0,0

12.496,7

91.269


5

Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm (1993), bệnh cháy bìa lá gồm ba dạng triệu chứng: héo
xanh (kresek), vàng lá và cháy bìa lá.
Theo Ou (1972), triệu chứng “kresek” được hai nhà khoa học người Indonesia là
Reitsma và Schure tìm thấy vào năm 1950. Một hoặc hai tuần lễ sau khi cấy, các lá bị
bệnh trở nên xanh xám nhạt và bắt đầu gập, cuộn lại dọc theo gân chính. Ở lúa cấy có lá
bị cắt, bên dưới mặt cắt có đốm úng nước, sau đó đổi sang màu xanh xám, toàn bộ lá bị
cuộn lại và héo, tiếp đến là bẹ lá. Vi khuẩn truyền theo mạch dẫn đến những vùng tăng
trưởng của cây non và bệnh lây truyền đến gốc các lá khác, khiến cho cây non bị chết toàn
bộ.
Triệu chứng vàng lá thường xuất hiện vào giai đoạn lúa lớn. Khi cây lúa bị nhiễm
bệnh, các lá già vẫn xanh bình thường, các lá non bị vàng nhạt không đồng đều, trên
phiến lá có sọc rộng màu vàng hoặc vàng xanh nhạt. Trong các lá vàng này không tìm
thấy vi khuẩn, nhưng ở các đốt và lóng ngay bên dưới lá bệnh sẽ có rất nhiều vi khuẩn. Vi
khuẩn ở đây sẽ nhân mật số và hạn chế việc đưa dinh dưỡng lên lá làm cho lá bị vàng.
Triệu chứng có thể xuất hiện sau khi vi khuẩn xâm nhiễm 20-30 ngày (Ou, 1972).
Triệu chứng cháy bìa lá thường xuất hiện ở giai đoạn lúa trổ, tuy nhiên cũng có khi
bệnh gây hại trên mạ. Trên mạ, bìa của các lá bên dưới có những đốm úng nước nhỏ, đốm
lớn dần ra làm lá trở nên vàng và khô héo. Trên lá lúa triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt
hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng vết bệnh có
những đặc điểm điển hình chung như ban đầu trên phiến lá có những đường kẻ dài không
đều, hoặc ở chóp lá tạo thành một sọc dài nhũng nước hay ở hai bên bìa lá, khi đẫm nước
vết bệnh sẽ lan dài ra những vết có màu vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám
khô chạy theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá bị quăn queo và lan ra khắp lá, vết bệnh lan
nhanh chóng xuống phần bẹ lá, lá bị khô nhanh chóng và cuộn lại (Sharma, 2006). Vết
bệnh đầu tiên xuất hiện ở chóp lá hay mép lá thường nhỏ, trông giống như những giọt dầu
có màu xanh xám nhạt, sau đó vết bệnh lan rộng trở nên vàng và héo khô nhanh chóng.
Các vết bệnh có thể xuất hiện ở một hoặc cả hai rìa mép lá, sau đó phát triển rộng phủ kín
cả mặt lá, các vết bệnh sau đó biến thành màu nâu xám (Hình 1). Vào sáng sớm có thể

mô, bìa nguyên, bề mặt khuẩn lạc ướt. Vi khuẩn Xoo háo khí, không làm hóa lỏng getalin,
không tiêu thụ nitrat, không sản sinh amoniac, sản sinh khí H
2
S nhẹ. Vi khuẩn Xoo không
sản sinh Indol, men của Xoo không làm đông sữa, không sản sinh khí và acid từ đường
saccharose (Ou, 1972).
Môi trường nuôi cấy thường dùng là Wakimoto cải tiến (Karganilla et al., 1973).
Nhiệt độ tối thích cho Xoo phát triển là 25-30
o
C và pH là 6-6,5 (Fang et al., 1957). Theo
Ou (1972), Xoo không sống lâu trong nước cất vô trùng, nhưng sống khá lâu trong buffer
phosphate pH = 7 và trong nước có pha peptone. Tốt nhất là giữ trong huyền phù đất sét
hạt mịn, sau hơn 12 tháng tỉ lệ sống của vi khuẩn Xoo vẫn rất cao. Vi khuẩn Xoo tiết độc
tố phenylacetic acid trong môi trường nuôi cấy và trong lá bệnh, Xoo còn tổng hợp
enzyme phân giải protein và cellulose. Vi khuẩn Xoo rất dễ kháng streptomycin, đối với
các kháng sinh khác thì kháng ít hơn.
Theo Ou (1972) các vết thương trên lá là những đường xâm nhập phổ biến và thuận
lợi. Vi khuẩn xâm nhập vào thủy khổng và nhân lên trong biểu mô, một số vi khuẩn xâm
nhập vào hệ thống mạch dẫn, một số khác thoát ra ngoài qua thủy khổng (Tabei và Muko,
1960). Ngoài ra, vi khuẩn còn xâm nhập vào rễ qua các chỗ đứt, đây cũng là con đường
gây bệnh quan trọng (Mizukami, 1957).
2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh
Bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng, trổ và chín sữa (Lê Lương
Tề, 2000). Ở Nhật Bản, bệnh thường xuất hiện vào giai đoạn cây lúa đẻ nhánh rộ hoặc
cuối giai đoạn mạ (Ou, 1972).
Sự phát sinh phát triển và mức độ tác hại của bệnh cháy bìa lá phụ thuộc vào thời
tiết (nhiệt độ, ẩm độ), đặc điểm của giống lúa và giai đoạn sinh trưởng, chế độ dinh dưỡng
phân bón, nước… (Lê Lương Tề, 2000).
Theo Vũ Triệu Mân (2003), trong điều kiện bình thường, bệnh lan truyền qua hạt
giống, lây qua vết thương cơ giới và qua đất trồng trọt nếu đất không được luân canh hay

do đây là biện pháp thuận tiện nhất khi ứng dụng vào sản xuất. Mặc dù đã có hơn 30 gen
kháng bệnh cháy bìa lá được tìm thấy (Verdier et al., 2012) nhưng mỗi gen chỉ có khả
năng kháng với một hoặc một vài nòi vi khuẩn Xoo (theo thuyết Gen-đối-gen của Flor).
Trong khi đó, vi khuẩn này có rất nhiều nòi khác nhau. Cho đến nay, Viện Nghiên cứu
Lúa Quốc tế đã liệt kê được 14 nòi Xoo chuẩn, đặt tên từ 1 đến 10; trong đó nòi 3 gồm 3B
và 3C và nòi 9 gồm 9a, 9b, 9c, và 9d (Khoa, 2005). Bên cạnh đó, trong quá trình tiến hóa
được xem là rất nhanh của mầm bệnh, vẫn còn khả năng các nòi Xoo khác sẽ được tìm
thấy. Như vậy, để có thể phòng trừ bệnh cháy bìa lá hiệu quả bằng giống kháng, chúng ta
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
9

cần phải biết hiện tại trên ruộng lúa có những nòi Xoo nào để triển khai đúng giống kháng
tương thích. Việc này không đơn giản do phải ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tốn
kém để xác định nòi Xoo; hơn nữa, trong khi việc lai tạo giống kháng rất tốn thời gian thì
quần thể vi khuẩn Xoo luôn có khả năng biến đổi về mặt di truyền rất nhanh (thay đổi cấu
trúc nòi trong quần thể) để phá vỡ tính kháng của cây lúa. Vì vậy, biện pháp phòng trừ
bệnh cháy bìa lá bằng giống kháng thường không cho hiệu quả lâu dài và vì thế khó triển
khai ứng dụng.
2.2.3. Biện pháp hóa học
Để phòng trừ bệnh cháy bìa lá có thể rắc 56-83 kg vôi trên một ha hoặc phun
Kasuran 0,1-0,2%. Ngoài ra, còn có thể phun Kasumin 21, Xanthomix 20 WP, Cuproxat
345 SC, Staner 20WP, Sasa 20WP hoặc Asusu 20WP (Lê Lương Tề, 2000). Phòng trừ
bệnh cháy bìa lá bằng biện pháp hóa học có thể trừ bệnh nhanh chóng và hiệu quả. Tuy
nhiên, nếu sử dụng thuốc không hợp lý, sai phương pháp sẽ mang đến hiệu quả thấp, gây
ô nhiễm môi trường đất, nguồn nước, trực tiếp gây độc cho người, sinh vật có ích hoặc để
lại dư lượng chất hóa học trong nông sản vượt mức cho phép, gây ngộ độc thực phẩm cho
người và gia súc. Nếu sử dụng liên tục một loại thuốc trừ bệnh ở một vùng sẽ dẫn đến kết
quả làm vi sinh vật quen thuốc và kháng thuốc (Vũ Triệu Mân et al., 2007).
2.2.4. Biện pháp sinh học

Paenibacillus polymyxa HKA-15 phân lập từ cây đậu nành có khả năng ức chế mầm bệnh
cháy bìa lá Xoo trên lúa. Bên cạnh vi khuẩn, xạ khuẩn Streptomyces cũng được thử
nghiệm khả năng đối kháng với vi khuẩn Xoo nhưng không mang lại kết quả khả quan
(Ndonde và Semu, 2000). Biện pháp phòng trừ bệnh cháy bìa lá bằng vi sinh vật đối
kháng hiện đang bắt đầu được tập trung nghiên cứu trở lại.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng có khả năng phòng trừ bệnh
cháy bìa lá vẫn còn rất hạn chế, chỉ tìm được thông tin của Nguyễn Hồng Anh (2011) và
Nguyễn Đình Hải (2012) về chủ đề này, trong đó Nguyễn Hồng Anh chọn lọc được chủng
xạ khuẩn VN10-A44 có khả năng đối kháng với mầm bệnh Xoo và Nguyễn Đình Hải đã
xác định được chủng xạ khuẩn VN08A12 có tiềm năng đối kháng với Xoo là
Streptomyces toxytricini, cải tiến môi trường sinh kháng sinh và khẳng định VN08A12
không gây hại cho các sinh vật có ích trong môi trường sống.
Phòng trừ bệnh cháy bìa là bằng vi khuẩn đối kháng tuy hiệu quả chậm hơn thuốc
hóa học nhưng hiệu quả lâu dài, thường không độc với con người và môi trường, bảo vệ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
11

được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, hạn chế tình trạng bùng phát bệnh, tránh được
dư lượng chất hóa học độc hại trên nông sản, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần
quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả.
2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn
Hiện nay, do sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều loài vi khuẩn đã
được định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA. Các trình tự nucleotide của vi
khuẩn được lưu trữ trên các cơ sở dữ liệu lớn và việc tìm kiếm thông tin về trình tự
nucleotide cũng rất đơn giản nên việc định danh vi khuẩn chủ yếu dựa vào kỹ thuật giải
trình tự gen 16S rRNA. Tuy nhiên, kết quả định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự
còn gây nhiều tranh cãi, nên ở đề tài này vi khuẩn được định danh bằng cách kết hợp kỹ
thuật giải trình tự gen 16S rRNA và phương pháp truyền thống sử dụng hệ thống phân
loại của Bergey (John et al., 1994) để tăng độ tin cậy.

khả năng làm tăng tính acid của môi trường nuôi cấy gây sai lệch kết quả. Tốt nhất nên
nhuộm Gram với lứa cấy từ 18-24 giờ.
+ Dung dịch Lugol bị hỏng: phải bảo quản dung dịch lugol trong chai nâu,
tránh ánh sáng và cần loại bỏ ngay khi thấy dung dịch chuyển màu từ nâu sang vàng.
+ Tẩy màu quá mức: nhỏ quá nhiều cồn hoặc không rửa nước ngay. Nếu nhỏ từ
từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến kính bạc màu đi, thông thường từ 10-15 giây. Rửa
ngay với nước để chấm dứt công đoạn tẩy màu.
- Nguyên nhân làm cho vi khuẩn Gram âm lại cho kết quả Gram dương:
+ Cố định tiêu bản khi còn ướt, các hợp chất protein có trong môi trường hoặc
trong mẫu vi khuẩn làm tiêu bản khó tẩy màu.
+ Tẩy màu chưa đạt.
+ Vết bôi vi khuẩn quá dày.
b) Khảo sát hình thái kích thước và sự liên kết tế bào
Sau bước nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát qua tiêu bản sống dưới kính hiển vi
quang học với độ phóng đại 1000 lần để xác định hình dạng, kích thước và sự liên kết của
tế bào.
Theo Phạm Văn Kim (2007), vi khuẩn có ba hình dạng chính là cầu khuẩn (coccus),
trực khuẩn (bacille, monas) và xoắn khuẩn (spira). Giữa ba loại này thường có những
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
13

dạng trung gian. Thí dụ như dạng cầu trực khuẩn (coccobacille) hoặc dạng phẩy khuẩn
(vibrie).
* Cầu khuẩn: là loại vi khuẩn có hình cầu, hình hạt cà phê nhưng cũng có thể là hình
bầu dục hoặc ngọn nến, có đường kính trung bình khoảng 0,5-1 µm. Cầu khuẩn được chia
thành một số loại sau:
- Đơn cầu (Micrococcus): vi khuẩn hình cầu, sống riêng lẻ, sống hoại sinh trong đất,
nước, không khí.
- Song cầu (Diplococci) là những cầu khuẩn liên kết với nhau thành từng đôi (do