BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
=======oOo======
NGUYỄN QUỐC HOÀN
GÓ P PHẦN NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG ARTESUNATE
TRONG VIÊN NÉN BANG PHƯƠNG PHÁP
ĐO QUANG PHỔ HÂP THỤ TỬ NGOẠI - KHẢ KIÊN
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn: PGS. TS. Trần Đức Hậu
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: 03/2003 - 05/2003
Lời cảm ơn
Sau quá trình nghiên cứu học tập tại trường tôi đã nhận được đề tài “ Góp
phần nghiên cứu định lượng ffrtesunate trong viên nén bằng
phương pháp đo quang phổ hấp íhụ íử ngoại - hhả hiến” do PGS.
TS. Trần Đức Hậu trực tiếp hướng dẫn.
Trước nhất xỉn cho tôi tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trần Đức
Hậu - Người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khoá
luận này.
Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên ở bộ
môn Hoá Dược đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điêu kiện để tôi hoàn thành
tốt khoá luận của mình.
Nhân dịp này tôi cũng xin được bày tỏ lồng biết ơn tới những thầy cô đã
dìu dắt, giảng dạy tôi trong những năm học tập tại trường.
Cuối cùng tôi vô cùng cám ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động
viên và hết lòng giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2003
Sinh viên: Nguyễn Quốc Hoàn
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề 1
Phần 1 - Tổng quan 3

Tài liệu tham khảo
ĐẶT VÂN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh xã hội gây ra bởi ký sinh trùng sốt rét thuộc chi
Plasmodium. Những loài gây bệnh cho người thường gặp là:
Plasmodium falciparum: là loài chủ yếu, tỷ lệ mắc bệnh là 70%.
Plasmodium malariae: tỷ lệ mắc bệnh là 20 - 30%.
Plasmodium vivax: tỷ lệ mắc bệnh là 1 - 2%.
Plasmodium ovale: tỷ lệ mắc bệnh rất thấp chỉ khoảng 0,5%.
Bệnh sốt rét phát triển ở nhiều nước trên Thế giới, đặc biệt là những nơi có
khí hậu ẩm thấp (nóng, ẩm, mưa nhiều) như nước ta. Tác nhân truyền bệnh là
muỗi. Bệnh sốt rét là bệnh gây nguy hại lớn đến sức khoẻ của con người, thể
ác tính có thể dẫn tới tử vong. Dịch tễ bệnh rất phức tạp, bệnh có thể lan thành
dịch nếu không được phát hiện và ngăn chặn kịp thời.
Cho đến nay, mặc dù đã có rất nhiều đầu tư nghiên cứu nhưng việc kiểm
soát bệnh vẫn rất khó khăn, do đó vai trò của thuốc trong điều trị và dự phòng
sốt rét là hết sức quan trọng. Nhưng một số loại thuốc trước đây được coi là
đặc hiệu hiện đã bị kháng, đặc biệt là Chloroquin đã bị kháng trên 60 quốc gia
trong đó có Việt Nam [11]. Vì thế việc tìm kiếm và đưa vào sử dụng các thuốc
mới trong điều trị sốt rét luôn là một vấn đề lớn được đặt ra với những nhà
nghiến cứu [16].
Artesunate là một trong những dẫn chất của Artemisinin thuộc nhóm thuốc
điều trị sốt rét mới (Artemisinin được chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng).
Nhiều nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới đã công nhận những ưu điểm
của nhóm thuốc này: cắt sốt nhanh, ít độc cho cơ thể, có khả năng qua được
hàng rào máu não để điều trị sốt rét thể não.
Ở Việt Nam Artesunate đã được sản xuất và được sản xuất với quy mô
ngày càng lớn, đồng thời đã được Bộ Y tế công nhận là thuốc điều trị sốt rét
chủ yếu trong chương trình chống sốt rét quốc gia ở cả hai dạng viên nén và
1
dạng tiêm. Chính vì vậy việc kiểm tra và đánh giá chất lượng của các sản

3
trước đó sốt rét đã bị đẩy lùi, nhưng giờ đây đang phát triển mạnh trở lại. Hiện
nay, ký sinh trùng sốt rét đã kháng hầu hết các thuốc quen thuộc vẫn .dùng để
phòng và điều trị trong thời gian qua. Cloroquin đã bị Plasmodium falciparum
kháng khoảng 60%, các thuốc như Fansida cũng đã bị kháng khoảng 30 -
35%. Mefloquin tác dụng khá tốt nhưng giá thành cao và hiện cũng đã bắt đầu
bị kháng. Quinin ít bị ký sinh trùng kháng hơn nhưng lại có một số tác dụng
phụ gây khó khăn cho bệnh nhân. Chính vì vậy, nhóm thuốc Artemisinin và
dẫn chất khi mới được đưa ra áp dụng điều trị sốt rét đã gây được tiếng vang
lớn và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học [12,15]
Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết được từ lá
cây thanh hao hoa vàng một loại hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét có tên
gọi là Quinghao Su (QHS) hay là Artemisinin chất này đã được chứng tỏ hiệu
lực chống sốt rét tốt kể cả với những bệnh nhân mắc chứng kháng thuốc. Hơn
thế nữa, Artemisinin và dẫn chất của nó có thể vượt qua hàng rào máu não nên
rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [8]. Tuy nhiên, do độ tan của
Artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao nên tác
dụng điều trị của Artemisinin phẩn nào còn bị hạn chế. Để hoàn thiện khả
năng của Artemisinin, những năm đầu thập kỷ 80, các nhà khoa học đã tiếp
tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ Artemisinin như:
Artesunate, Artemether, Arteether, acid Artelinic có tác dụng điều trị cao
hơn chất gốc, đồng thời có thể sử dụng được cho cả đường tiêm. Trong số đó
thì Artesunate là chất được dùng phổ biến nhất. Hiện nay, ở Việt Nam đã có
nhiều cơ sở sản xuất Artemisinin dạng viên để uống và Artesunate dạng uống
và dạng tiêm để đáp ứng nhu cầu của nhân dân. Vì vậy, vấn đề cần quan tâm
của các nhà sản xuất và quản lý là đảm bảo công tác kiểm tra chất lượng
thuốc. Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước về các mặt khác nhau
của nhóm thuốc này như tác dụng dược lý, độc tính, dạng bào chế, v.v về
kiểm nghiệm, cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về định tính, định lượng
4

hái vào tháng 8 - lúc cây chuẩn bị ra hoa [2]
1.2.3 - Tác dụng và công dụng
Theo YHCT Việt Nam, thanh hao hoa vàng có vị đắng (khổ), tính lạnh
(hàn) quy vào hai kinh can, đởm. Có tác dụng thanh thư tịnh uế, trừ phục nhiệt
ở âm phận dùng chữa những trường hợp cốt chưng lao nhiệt (đau xương,
nóng), đạo hãn (ra mồ hôi trộm), ngược tật (sốt rét), lở ngứa. Còn dùng chữa
mạo cảm, thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi gan mật. Có thể dùng riêng hoặc phối
hợp với các thuốc khác [9]. Theo khoa học hiện đại, dùng làm nguyên liệu
chiết Artemisinin để chữa bệnh sốt rét.
1.2.4 - Thành phần hoá học
Tất cả các bộ phận của cây thanh hao hoa vàng đều chứa tinh dầu và hàm
lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi trồng,
dao động từ 0,5 - 0,6%. Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi long não với
thành phần chủ yếu là Camphor, Artemisia ceton, P-myrcen [2,9,14].
Trong thành phần tinh dầu này thì hoạt chất chính có tác dụng điều trị sốt
rét là Artemisinin đã được các nhà khoa học Trung Quốc chiết tách và xác
định cấu trúc từ năm 1972, Artemisinin là một Secquiterpen lacton có cầu nối
peroxyd nội phân tử, chính nhóm này quyết định tác dụng diệt ký sinh trùng
sốt rét. Bên cạnh Artemisinin, người ta còn xác định được một loạt các hợp
chất Secquiterpen khác như sau [14]
6
Artemisin D eoxy artemisinin
Artemisitin
Arteannuin c Arteannuin B Epideoxyarteannuin B
Acid Artemisinic Arteannuin A Quinghao Su IV
(Quinghao Su I)
CH3
I
Arteannuin E
Deox y artem isin in

Artemeter Arteeter
Hình 1.4: Công thức của Artemether và Arteether
Hiện nay người ta đã tổng hợp ra một dẫn chất mới có hoạt lực cao trên ký
sinh trùng sốt rét đó là acid Artelinic. Chất này vừa có hiệu lực cao hơn
9
Artesunate và AM, mặt khác muối Natri của nó lại tan tốt trong nước nên có
thể chế được cả dạng uống lẫn dạng tiêm [1].
H^C
h CH3
h CH3
HiC
,-H
ÓCH2— H ^ ) ^ C 0 0 R
Thuỷ Phân
Hình 1.5: Sơ đồ tổng hợp acid Artelinic
1.3.2 - Đại cương về Artesunate
Công thức cấu tạo
HiC
(X .COOH
0
Hình 1.6: Công thức của Artesunate
10
I
- Công thức phân tử: C19H280g
- Trọng lượng phân tử: 384,42
- Tên khoa học: a-Dihydroartemisinin hydrosuccinic.
- Tên khác: acid Artesunic
- Tính chất của Artesunate [4].
Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi và thực tế không vị.
Rất khó tan trong nước, rất tan trong Dicloromethan, dễ tan trong Ethanol,

bằng 41 phút. Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển
hoá tại gan. Thuốc qua được hàng rào rau thai nên tránh dùng cho phụ
nữ có thai. Artesunate thải trừ qua nước tiểu và các chất thải trừ tìm
thấy trong nước tiểu gồm 9,10-Dihydroartemisinin, Deoxyartemisinin,
Dihydrodeoxyartemisinin.
- Tương tác thuốc: tác dụng của Artesunate là do cầu nối peroxyd đem
lại. Vì một lý do nào nào đó mà phân tử Artesunate bị mất cầu nối này
thì nó không còn tác dụng nữa. Do đó tác dụng của Artesunate sẽ bị
giảm đi khi có mặt của chất xúc tác thuỷ phân như Catalase hay các
chất khử như acid Ascorbic, Vitamin E, Glutathion dạng khử và tác
dụng tăng lên khi có mặt các chất oxy hoá gây stress như Misconasol,
Doxarubicin
- Các thuốc chống sốt rét khác như: Mefloquin, Primaquin, Chloroquin
khi phối hợp với Artesunate cho tác dụng hiệp đồng tăng cường hay
hiệp đồng cộng. Ngược lại các chất kháng Folat như Pyrimithamin,
Sulphamid lại có tác dụng đối kháng [8].
■ Chế phẩm và cách dùng Artesunate trong điều trị:
- Chế phẩm:
• Biệt dược: Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng trên 10
biệt dược chế phẩm Artesunate ở hai dạng bào chế:
• Dạng bào chế:
Viên nén 50 mg
12
Bột pha tiêm: lọ chứa 60mg acid Artesunic ở dạng bột khô vô trùng
kèm ống tiêm có chứa lml dung dịch Natrihydrocarbonat 5% trong
nước cất.
- Chỉ định: Điều trị sốt rét do Plasmodium fanciparum, Plasmodium
vivax, Plasmodium malarie, kể cả sốt rét do nhiễm Plasmodium
fanciparum đã kháng các loại thuốc khác.
- Liều dùng:

Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử
nghiệm Artesunate trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân nhiễm Plasmodium
faciparum không biến chứng. Kết quả:
Khi thử trên người khoẻ mạnh không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá,
điện tim trước và sau khi thử. Tại chỗ tiêm không có phản ứng, không đỏ,
không mẩn ngứa. Thuốc khuyếch tán nhanh. Dấu hiệu chủ quan: người tình
nguyện không thấy có cảm giác gì đặc biệt sau khi tiêm.
Với bệnh nhân nhiễm Plasmodium faciparum không biến chứng: thuốc có
hiệu quả điều trị trên mọi đối tượng bệnh (cả người lớn và trẻ em) có tác dụng
mạnh với ký sinh trùng sốt rét, làm giảm nhanh mật độ của ký sinh trùng (đa
số trong vòng 24 giờ đầu), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng.
Thuốc không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh
hưởng gì đến hệ tim mạch.
1.3.3 - Điểm qua một sô phương pháp định lượng hiện nay
1.3.3.1 - Các phương pháp định lượng Artesunate trên nguyên liệu
*Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại
Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunate chuyển thành Q289
là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm, do đó có thể định
lượng Artesunate trong chế phẩm và trong nguyên liệu bằng phương pháp đo
độ hấp thụ cuả sản phẩm thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ồ bước
sóng 289nm.
14
Artesunate sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm
sau[ll,14,16]:
CH3
H :
coơ
I
h 3c
COOH

cho việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật. Tuy nhiên,
không phải cơ sở nào cũng có đủ trang thiết bị để áp dụng phương pháp này
*Phương pháp HPLC với detector khúc xạ kế
Định lượng Artesunate với pha tĩnh là cột RP18 (12,5cmx3,5mm) cỡ hạt
5|um, pha động là acetonitril - đệm pH3 (l,36g KH2P04 trong 11 nước, điều
chỉnh tới pH3 bằng H3PO4) với tỷ lệ 1:1. Tốc độ dòng 0,6ml/phút, nồng độ
dung dịch mẫu 4mg/ml, thể tích tiêm mẫu 20|ul, detector khúc xạ kế.
* Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan [22]:
Dựa vào nhóm acid tự do còn lại trong phân tử Artesunate để tiến hành
định lượng. Chế phẩm (~ 0,2g) được hoà tan trong Ethanol tuyệt đối(50ml).
Chuẩn độ bằng dung dịch Tetrabuthylaminonium hydroxyd trong 2-Propanol
(0,lmol/l). Điểm kết thúc của phép định lượng xác định bằng chỉ thị tím tinh
thể trong acid Acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm dừng.
H3C
ÒR
Hình 1.8: Sơ đồ khử cực của Artesunate trên bề mặt điện cực.
16
* Phương pháp chuẩn độ acid - base:
Cũng dựa vào nhóm acid tự do người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm
chức này bằng dung dịch NaOH với chỉ thị là Phenolphtalein, từ đó suy ra
hàm lượng Artesunate. Hoặc có thể định lượng Artesunate bằng phương pháp
chuẩn độ gián tiếp. Cho Artesunate tác dụng với một lượng dư KOH rồi chuẩn
độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn acid.
Nhận xét: phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng khi không có acid
Succinic tự do trong chế phẩm, nên khó có thể áp dụng cho định lượng viên
nén. Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp dễ thực hiện song
phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng nguyên
liệu Artesunate, muốn áp dụng trong định lượng các dạng bào chế Artesunate
thì cần được nghiên cứu thêm.
* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiêh[ 15]:

45 phút sau đó làm nguội nhanh bằng nước máy. Thêm tiếp 4ml dung dịch
acid Acetic 1,1M, lắc đều. Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5%, lắc đều. Thêm
tiếp 10ml dung dịch thuốc thử Diazoni (mới pha khoảng 15 phút trước đó).
Thêm nước cất vừa đủ 50ml, trộn đều. Để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước
sóng 345nm. Song song tiến hành với mẫu trắng (không có 5ml dung dịch A)
và mẫu thử.
1.3.3.2 - Các phương pháp định lượng Artesunate trong viên nén đang
được áp dụng ở nước ta
*Phương pháp quang phổ [4]
Cân 0,130g chế phẩm chuyển vào bình định mức 100ml, hoà tan bằng
Ethanol tuyệt đối, thêm dung môi tới vạch và lắc đều. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc
đầu. Lấy chính xác 5,0ml dịch lọc tiếp theo chuyển vào bình định mức 50ml,
thêm dunh dịch NaOH 0,1N đến vạch. Làm ấm trong nồi cách thuỷ 50±l°c
trong 60 phút. Làm nguội nhanh bằng nước lạnh. Đo độ hấp thụ của dung dịch
18
thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289±lnm, cốc đo dày lcm và mẫu
trắng là dung dịch NaOH 0,1N.
Tính hàm lượng Artesunate trong chế phẩm bằng cách so sánh với
Artesunate chuẩn được tiến hành trong cùng điều kiện.
*Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước:
Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,150g Artesunate
vào bình nón 100ml. Hoà tan bằng Ethanol tuyệt đối đã được trung tính với
chỉ thị Phenolphtalein và lắc kỹ. Thêm hai giọt chỉ thị Phenolphtalein và
chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
lml dung dịch NaOH 0,05N tương ứng với 19,22mg Artesunate.
1.4 - Nhận xét và lựa chọn
Phương pháp HPLC với detector điện hoá có khả năng phân tích tốt, tính
đúng và tính đặc hiệu cao, song hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa thể áp dụng
được.
Các phương pháp HPLC với detector 253nm có thể không phải trực tiếp

nghiên cứu định lượng Artesunate trong nguyên liệu [11] chúng tôi tiến hành:
- Khảo sát các điều kiện định lượng Artesunate trong viên nén theo
phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 345nm.
- Xây dựng và đánh giá phương pháp.
- Áp dụng định lượng một số chế phẩm viên nén Artesunate đang lưu
hành trên thị trường Việt Nam.
20
2.3 - Kết quả nghiên cứu
2.3.1 - Khảo sát cơ sở
* Theo bảng tóm tắt [21] thì thuốc thử tạo màu là Fast TR red salt nhưng hiện
tại do điều kiện chưa có thuốc thử này nên chúng tôi vẫn dùng thuốc thử
diazoni như [11]. Cụ thể là thuốc thử diazoni được pha dựa vào Dược điển
quốc tế (DĐQT) có sửa đổi như sau:
Dược điển quốc tế:
Cân 0,9g acid Sulphanilic và thêm 10ml dung dịch acid Hydroclorid
(250gA), thêm nước cất vừa đủ 100ml được dung dịch 1.
Lấy 3ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 100ml khác, thêm 5ml dung
dịch Natrinitrit (3g/l) làm lạnh trong nước đá 5 phút. Thêm 20ml dung dịch
Natrinitrit (3g/l) và tiếp tục làm lạnh trong nước đá, thêm nước cất vừa đủ. Bảo
quản trong nước đá. (Diazobenzensulfonic acid phải được pha ngay vặ phải để
ít nhất 15 phút mới được dùng).
Theo cách pha này nồng độ thuốc thử là ~ 0,34mg/ml mà theo [21] thì
nồng độ thuốc thử Fast TR red salt là 5mg/ml (dung môi là nước cất) do đó
chúng tôi sửa lại là:
Lấy 20ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 100ml khác, thêm 5ml
Natrinitrit 2%, làm lạnh trong nước đá 10 phút, thêm tiếp 20ml dung dịch
Natrinitrit 2% tiếp tục làm lạnh trong nước đá, thêm nước cất vừa đủ 100ml.
Bảo quản trong nước đá và sử dụng sau 15 phút.
* Dựa vào cách tiến hành trên nguyên liệu như [11], lúc đầu chúng tôi tiến
hành trên viên nén theo qúy trình sau:

Cân 0,090g Artesunate cho vào bình định mức 50ml hoà tan bằng Ethanol
tuyệt đối, thêm Ethanol tới vạch cho đủ 50ml. Hút Chính xác 5ml dung dịch
trên vào bình định mức 50ml khác. Thêm 15ml NaOH 0,2N, lắc đều. Đun
cách thuỷ ở nhiệt độ 50 ± l°c trong 45 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng
nước máy. Thêm nước cất tói vạch. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 289nm.
22