_
A a'
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
■ ■ ■ ■
TỐNG THỊ THANG VƯỢNG
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN
DI MAO QUẢN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN:
■ ■
b19 b2, b6, pp tr o n g chê p h ẩ m th u ố c t iê m
BECOZYME
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn : GVC NGUYEN v ă n TUYỀN
GVC TRẦN TÍCH
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH
Thời gian thực hiện : 3-5/2003
HÀ NỘI-05/ 2003
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
GVC: NGUYỄN VĂN TUYỀN
GVC: TRẦN TÍCH
đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian học tập và thực hiện khoá luận
này.
Em cũng xin bầy tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong bộ môn
HOÁ PHÂN TÍCH - Trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội ngày 1/6/2003
Sinh viên
TỐNG THI THANH VƯƠNG
MỤC LỤC

2.2.4.Xây dựng đường chuẩn định lượng các vitamin bằng phương
pháp thêm chuẩn trong CE 20
2.2.5.Xác định tính đúng của phương pháp

24
2.2.6.Xác định độ lặp lại của phương pháp
25
B/Phương pháp HPLC 26
2.2.7.Xây dựng đường chuẩn định lượng các vitamin trong HPLC 26
C/Biện luận kết quả 31
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
ĐẬT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thị trường dược phẩm thế giới cũng như thị trường dược
phẩm Việt Nam đang lưu hành nhiều chế phẩm vitamin đa thành phần, được
sản xuất trong nước cũng như nhập từ nước ngoài. Các chế phẩm này rất đa
dạng về mặt bào chế (thuốc tiêm, viên, bột, nước ) và rất phong phú về sự
phối hợp các vitamin và các thành phần dược chất khác. Sự phối hợp các
vitamin trong các thuốc có thể sơ bộ chia ra thành 2 loại:
- Các chế phẩm phối hợp các vitamin tan trong nước: Bj, B2, B5, Bg,
B12, pp, c. Nhóm này chiếm số lượng nhiều nhất.
- Các chế phẩm phối hợp nhóm vitamin tan trong nước, nhóm tan trong
dầu (vitamin A,D,E), các acid amin và các vi lượng khoáng.
Đây là các dạng thuốc phức tạp cả về kỹ thuật bào chế lẫn kỹ thuật
kiểm tra chất lượng và đặc biệt khó trong việc định lượng riêng biệt từng
thành phần vitamin do trong công thức có chứa nhiều loại hoạt chất cộng
thêm các chất bảo quản và tá dược.
Hiện nay đa số các dược điển chưa đưa các phương pháp định lượng
riêng biệt các vitamin trong các chế phẩm đa thành phần mà chỉ có phương
pháp áp dụng cho các chế phẩm chứa 1 thành phần.

PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ ĐIỆN DI MAO QUẢN
CAPILLARY ELECTRORESIS
1.1.1. Lịch sử ra đời và phát triển:[3]
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di
chuyển khác nhau của các phần tử chất trong dung dịch chất điện ly có pH ổn
định (bằng một hệ đệm thích hợp ) dưới tác dụng của điện trường E xác định
được tạo ra khi áp đặt một thế V vào hai đầu mao quản. Kỹ thuật tách này
được nghiên cứu và phát triển đầu tiên bởi Tiselius (1937) trên cơ sở tách và
phân tích các hỗn hợp protein, amin, amino acid bằng kỹ thuật CE thế thấp
(110-220 V).
Kỹ thuật tách và phân tích CE đã được phát triển rất nhanh, các công
trình nghiên cứu về kỹ thuật CE cũng liên tục tăng không ngừng nhất là sau
những năm 1985 và có ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
lĩnh vực y và sinh học.
Tại Việt Nam ta, vào năm 1996 đã bắt đầu có một số cán bộ của khoa
Hoá học, ĐHQG Hà Nội, đã nghiên cứu và tìm hiểu kỹ thuật này, tham gia
nghiên cứu cùng Phòng thí nghiệm Hoá Phân tích của trường ĐHTH
Amsterdam.
1.1.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản: Capillary
Electrophoresis (CE).[3][9]
Nguyên tắc của các kỹ thuật tách điện di mao quản CE là dựa trên cơ
sở sự di chuyển của các phần tử chất tan trong ống mao quản trên nền của
dung dịch chất điện ly (có chất đệm pH thích hợp), dưới tác dụng của một
3
điện trường E xác định được cung cấp bởi một nguồn điện thế cao một chiều
(10-50 KV) đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong ống
mao quản là sự di chuyển khác nhau của chất tan dưới tác dụng của lực điện
trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất của dòng chảy

L = Tổng độ dài của ống mao quản.
|iep=Độ điện di của chất tan.
*Vận tốc dòng điện thẩm: veo (The electro-osmotic velocity)
v &C, V
Ve. = m 0E = — X7-
T1 L
e=Hằng số điện môi của dung môi
C, = Thế Zêta
*Vận tốc của chất tan: Velocity of the solute (v)
v=v ± V
T T ep “ T eo
*Thời gian điện di (t)
t =
ỉ lxL
vep ±veo ” (nep ±ne0)v
1 = Chiều dài hiệu dụng cột
*SỐ đĩa lý thuyết của cột mao quản:
kpiuJxVxl
N ='
2x DxL
D = Hệ số khuyết tán của phân tử chất tan trong đệm
*Độ phân giải của hai chất (Rs):
u _ ^ ^ ( ^ e p b M-epa)
4(nep± n J
|iepa và |uepb=Độ di động hiệu dụng của hai chất a và b
J.I = Trung bình cộng của độ điện di hiệu dụng của 2 chất
Oep=l/2(|uepa+|iepb))
♦ Phân loại về CE[3]
Theo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách trong mao quản mà
người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau. Cụ thể gồm

số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm
giảm dòng EOF.
♦ Sơ đồ hệ thống điện di:[13]
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di
Gồm các bộ phận sau:
- Hai bình điện cực, các điện cực
- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-50 kV) biến thiên được.
- Cột tách- ống mao quản.
- Bộ phận nạp mẫu vào ống mao quản.
- Bộ phận phát hiện chất (detector).
7
- Bộ phận ghi sắc đồ (computer).
- Bộ phận điều nhiệt cho ống mao quản.
1.1.3. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học Micelle:
MEKC (Mỉcellary Capillary Electro-Kenetic).[3][9]
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Micelle trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt đóng góp thêm
khả năng của quá trình tách các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất
điện ly của quá trình điện di. Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng
kỹ thuật MEKC là được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt trong dung
dịch đệm điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ
ngưỡng của Micelle (chuẩn giới hạn hình thành Micelle, CMC: Critial
Micellary Concentration, ví dụ CMC =9 mM đối với chất hoạt động bề mặt
SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)), thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân
riêng biệt của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành
trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân đó. Nó chính là các
Micelle.
Hình 1.2: Cấu trúc các Micelle và dòng EOF trong MEKC
©
©

đối tượng mẫu.
- Việc phát hiện được thực hiện trên Rowcell chính là một đoạn cửa sổ
ở đầu cuối của ống mao quản, khác với Flowcell của HPLC.
- Lượng (thể tích) mẫu cần rất nhỏ, thường là từ 5-50 nl cho một lần
bơm mẫu vào cột tách.
- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế là rất
rộng rãi và đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước có chất đệm
pH và chất điện ly. Nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ đắt tiền như trong
HPLC nên rất kinh tế.
-Quá trình phân tích không phức tạp ( tương tự như trong HPLC).
- Sử dụng được nhiều bộ phận của trang bị HPLC, để tạo ra hệ CE.VÌ
thế cơ sở nào đã có HPLC thì dễ dàng phát triển và ứng dụng CE.
- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt.
Tuy nhiên do điện trở cao của mao quản, làm khó khăn dòng chảy nên
thường dễ xuất hiện hiệu ứng nhiệt Joule vì vậy phải khống chế nhiệt độ của
mao quản để đảm bảo thu được kết quả tách ổn định.
♦ Cách tính kết quả trong phương pháp CE
- Phương pháp đường chuẩn
- Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp một mẫu chuẩn
10
1.2.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNG LƯỢNG CÁC VITAMIN TAN
TRONG NƯỚC TRONG CHÊ PHẨM đa th à n h ph ầ n
1.2.1.Phương pháp cuả Dược điển Anh 2001 :[9] Định lượng Bv B2,
B6,PP,C trong chế phẩm thuốc tiêm.
*Yêu cầu hàm lươn2:
-Thiamine hydroclorid, C12H17ƠN4OS .HC1 đạt 92,0 đến 106,0% hàm lượng
ghi trên nhãn.
-Pyridoxin hydroclorid, C8HnN03 .HC1 đạt 90,0 đến 110,0% hàm lượng ghi

natri hexane sulfonat trong 100ml.
-Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác 80mg Nicotinamid
20mg Pyridoxin hydroclorid
20mg Riboflavin
20mg Thiamin hydroclorid
Đưa vào bình 200ml, thêm khoảng 180ml dung dịch pha loãng.
Ngâm trong nước ấm 65-70° thời gian khoảng 10 , lắc hoặc khuấy cho đến
khi chất rắn tan hết.
Làm lạnh ngay bằng nước lạnh khoảng 10 đến nhiệt độ phòng.Thêm dung
dịch pha loãng cho đủ thể tích và trộn đều.
-Dung dịch thử:
Nghiền và cân lượng bột không dưới 30 viên. Cân chính xác lượng bột tương
ứng chứa lOmg PP; 2,5mg mỗi vitamin Bj B2 B6 vào ống ly tâm 50ml.Thêm
25ml dung dịch pha loãng.Trộn bằng cách khuấy trong 30s để bột phân tán
hoàn toàn. Ngâm ống ly tâm trong nước ấm 65-70°, làm nóng trong 5 , khuấy
trộn trong 30s.
12
Lọc lấy phần dung dịch trong, làm lạnh đến nhiệt độ phòng.Dùng phần
dung dịch trong làm dung dịch thử. (Chú ý: Dùng dịch lọc trong vòng 3 giờ
sau khi lọc)
Cột 3,9mm X 30cm
Tốc độ dòng :lml/phút
Detertor 280nm
1.2.3.Các phương pháp ngoài dược điển.[6]
-Năm 1995, theo tài liệu phương pháp không Dược điển Đông Nam Á, có ghi
phương pháp địng lượng đồng thời 5 vitamin Bj, B2, B6, c, pp.
-Một số tác giả cũng giới thiệu chương trình định lượng vitamin Bj và EỊ,
trong đậu tương, định lượng 4 vitamin nhóm B, định lượng vitamin B12 trong
chế phẩm có chứa B1? B6 và B12

b6
b5
B12
pp
Becombion
Ong tiêm
X
X
X X X
X Merck
Pen-vita
Ong tiêm
X X X X
X X Choongwae
Enervon-C
Viên nén
X X
X X X X United Pharma
Pentazym Viên bao
X
X X
X
X
Danapha
Pencomzyme
Viên
X
X X
X X
Fourdiphar

Nevramin
Ông tiêm,viên
X X
Takeda
14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm:
2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
-Chất đối chiếu hoá học:
+Vitamin Bx: 99,67%
+Vitamin B2:100%
+Vitamin B6: 98,92%
+ Vitamin PP:99,3 %
-Ống tiêm Becozyme 2ml của hãng Roche (Visa VN:VN-2973-97)
Có thành phần là:Thiamin chlohydrate (Bj): 10 mg
Riboflavin natri phosphate (B2): 5,47 mg
Pyridoxin chlohydrate (B6): 4 mg
Nicotinamid (PP): 40 mg
Dexpanthenol (B5): 6 mg
Tá dược: phenol, acid chlohyric và nước
*Hoá chất:
Natri tetraborat (Merck).
Sodium dodecyl sulfat (SDS) (Merck).
Natri heptan sulfonat (Merck)
Acetonitril (HPLC grade - Merck ).
Methanol (HPLC grade - Merck ).
Acid acetic băng (HPLC grade - Merck ).
Diethylamin (PA grade - Merck ).
*Dụng cụ: +Máy điện di mao quản Hewlett Packard 3D CE.

16
Bảng 2.2: Dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích của phương pháp thêm
Các chất
Dẫy mẫu chuẩn
Mẫu số
Cx
c,
c2
c3
c4
Cs
Lượng mẫu thử (ml) 5
5 5 5 5
5
Thêm chất
chuẩn vitamin
(AC,mcg/ml)
B,
0
10 20 30 40
50
b2
0 10 20 30
40 50
b6
0 10
20 30 40
50
pp
0 20 40 60

Diện tích
Nồng độ
mcg/ml
Diện tích
Nồng độ
mcg/ml
Diện tích
10
75,86 10
33,98 10 61,82
10
22,91
30
218,58
30 96,74
30 198,45 50
103,52
50
371,45 50
170,47 50 314,26
100 221,56
70
523,06
70 232,31 70
442,71 150
313,52
90
654,74 90
190,12 90
574,84 200

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Cân chính xác mỗi chất đối chiếu 100 mg cho vào một bình định mức
100ml, hoà tan trong dung dịch đệm bằng cách lắc siêu âm 10 phút để thu
được các dung dịch chuẩn và nồng độ các vitamin tương ứng là 1 mg/ml.
(Đây là dung dịch chuẩn gốc).
Lấy chính xác 1 ml dung dịch thuốc tiêm cho vào bình định mức
100ml, hoà tan trong dung dịch đệm được dung dịch thử gốc.
Từ dung dịch chuẩn gốc và dung dịch thử gốc, lọc qua màng lọc 0,2|j.m và
pha 4 dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích với các nồng độ như bảng 2.2.
Tiến hành chạy điện di, xác định thời gian lưu và diện tích pic của các
vitamin tương ứng. Mỗi nồng độ chạy 3 lần, đo diện tích pic của từng vitamin
và lấy giá trị trung bình ta có bảng kết quả sau:
Bảng 2.4: Kết quả diện tích pic chạy MEKC
Các chất
Dẫy mẫu chuẩn
Mẫu số
Cx
c, c2
C,
c4
C5
Diện tích pic
trung bình 4
lần chạy
B,
184,65
250,62 334,50
413,49
490,81 545,23
b 2