BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SI

HÀ NỘI - 2012


MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................................2
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................1
Chương 1 : TỔNG QUAN.................................................................................................2
1.1 Đại cương về kháng sinh..................................................................................................2
1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh.........................................................................................................2
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh........................................................................................................................2
1.1.3 Phân loại kháng sinh..........................................................................................................................3
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh........................................................................................................3
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh............................................................................................................4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn....................................................................................................4
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.......................................................................................................4
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces.........................................................................................5

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)...................................................................7
1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn...............................................................8
1.4.1 Mục đích............................................................................................................................................8
1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên................................................................8

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.......................................................................................................17
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được.............................................................18

2.3 Phương pháp thực nghiệm............................................................................................18
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn........................................................................................................18
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán......................................................18
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên.........................................................................................................................19
2.3.4 Phương pháp đột biến.....................................................................................................................19
2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh.................................................................................................21
2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc...............................................................................22
2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ...............................................................22
2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng........................................................22
2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không...............................................................................23
2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột.......................................................................................23
2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được.............................................................................24

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT........................................................24
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên...........................................................................................24
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1................................................................................25
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2................................................................................26
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3................................................................................27
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh.....................................................................28
3.6 Kết quả chọn chủng lên men..........................................................................................29
3.7 Kết quả thử độ bền pH..................................................................................................30
3.8 Kết quả chọn dung môi và pH chiết................................................................................30
3.9 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi....................................................................31
3.10 Kết quả sắc ký cột........................................................................................................31
3.11 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết..................................35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................................36


Đột biến lần 2

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Hồng ngoại - Infrared

KS

Kháng sinh


MC

Mẫu chứng

MT


VSV

Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn............................................................15
Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.................................................16
Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng..........................................................................16
Bảng 4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên....................................................25
Bảng 5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1..............................................................26
Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2..............................................................27
Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3..............................................................28
Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men.............................................................29
Bảng 9: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt.................30
Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày.........31
Bảng 11: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau..................31
Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký...................................................32
Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1......................33


Bảng 14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........34
Bảng 15: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2......................34
Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........35
Bảng 17: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3............36
Bảng 18: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........36
Bảng 19: Biện giải các nhóm chức của phổ IR.......................................................37

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Hình 2: Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn.

VSV kháng thuốc diện rộng, kháng cả với những kháng sinh thế hệ mới. Đặc biệt,
hiện nay xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng chéo với nhiều loại
kháng sinh có cấu trúc tương tự nhau.Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất kháng
sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp
thiết trong công cuộc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do đó, bên cạnh việc
nghiên cứu sản xuất kháng sinh bằng phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp thì việc
tìm kiếm những kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên cần được chú trọng hơn nữa.
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có
nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi
lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ
Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận mong muốn đạt được
các mục tiêu sau đây:
-

Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

-

Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất.

-

Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.


2

Chương 1 : TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh

1.1.3 Phân loại kháng sinh
Danh sách các chất KS được phát minh đang ngày càng dài thêm (Tham
khảo Phụ lục 1) và việc phân loại chúng trở nên thật sự cần thiết.
Có nhiều cách phân loại KS: theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy
nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên
cứu có thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới
phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó [10].
 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm sau đây [8]:
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin…).
- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol…).
- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin…).
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin…).
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…).
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…).
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…).
- Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…).
- Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D…).
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào vi sinh
vật, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. [4]
 Có 6 kiểu chủ yếu: (Tham khảo phụ lục - Hình 2) [17]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein (Tham khảo phụ lục - Hình P3)
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian


ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[6]


5

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng, …[7]

Actinomycetes

Actinomycetales

Actinoplanaceae

Streptoverticulum

Streptomycetaceae

Streptomyces

VSV giống xạ khuẩn

Actinomycetaceae

…

Themostreptomyces

…

chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.[11]
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid.[11]


7

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)
Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí
nghiệm
Nhân giống quy mô thí nghiệm
Nhân giống trong thiết bị nhân giống
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men
Sinh khối

Dịch lọc

Sinh khối thô

Dịch chiết kháng sinh

Dịch chiết sinh khối

Dịch chiết đậm đặc

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm tinh chế

- Tác nhân vật lý:
+ Ánh sáng UV, tia X, tia

hay electron.

+ Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh sáng
UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước
nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới nhân.


9

+ Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu,
cường độ bức xạ.
+ Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục hoạt
(photoreactivation) : Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng
thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi.
- Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu.
1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái
hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ
thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.[15]
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang
môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ
phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông
lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).[13]
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi

thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinh
hay sử dụng phương pháp này.[10]


11

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả
sử dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và bổ sung
thêm MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực
tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc
là tác dụng gián tiếp.[13]
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử
dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng, rút ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai
đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ
hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt.[13]
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối
quan hệ chặt chẽ [9] (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự
hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử
có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng
lượng ánh sáng UV-VIS. [1]


13

1.7.2 Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ
IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng
hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[2]
1.7.3. Khối phổ (MS)
Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng
chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở
chân không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá
vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một
số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. [1]
Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất)
xác định cấu trúc và định lượng các chất.

1.8 Một số nghiên cứu liên quan
1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú
từ Streptomyces hygroscopicus [18]
Gendanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút
bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym
sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư… với nồng độ

dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải
bằng MeOH và aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh
chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate
=3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắc
khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giải là MeOH, tinh chế
phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2 lit môi trường. Tetrapetalone A
có IC50 là 190 (µM)


15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH
Dược Hà Nội cung cấp:
Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633
Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108
 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định
+ Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 1)
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
MT

MT1
Thành phần
Tinh bột
2

1,5

0,3
0,3
0,4
0,2

2
100
6,8-7,2

0,1
0,5
2
100

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút.
- Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như
môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.


16

+ Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 2):
Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
(%)

NaCl


Acetonitril
n-Butanol
Butylacetat
Cloroform
Diclorometan
Ethanol
Ethylacetat
NH4OH 25%
Methanol
Triethylamin

Khối lượng riêng (g/ml)
0,79
0,782-0,783
0,81
0,880-0,885
1,470-1,480
1,32
0,789-0,791
0,889-0,901
0,880
0,791-0,793
0,726-0,728

Nhiệt độ sôi (°C)
56
80-82
116-118
117-118
60-62

- Hộp Petri đường kính 9cm
- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong,
cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn,
đũa thủy tinh, kim mũi mác…

2.2 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội
dung nghiên cứu cụ thể như sau:
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn.
2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.
- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn
biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất
- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất


18

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS.
2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích
hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.