Bễ Y Tẫ

TRlTễNG DAI HOC Dĩ0C H NễI
m

N G U Y ấ N ANH LY

NGHIấN CtJU NH HUễNG CĩA NHIấT Dễ TễI
THNH PHAN HễA HOC
V TAC DUNG DlfOC

L CĩA VITHUOC HONG LIấN
(KHễA LUN TễT NGHIấP DLiỹc SẽKHO 1990 - 2003)

Nguối huomg dõn:

TS. PHNG HễA BẽNH
DS. NGUYấN THE MINH

Nai thirc hiờn:

Bụ mon Diùỗfc hoc co truyờn
Phong Vi sinh - Bụ mon Cụng
nghiờp duac
Phong nghiờn cuu trung tõm
Phong Duac l Viờn Duoc lieu

Thụi gian thuc hiờn: 3/2003 - 5/2003





2

1.2- Thnh phõn hoõ hoc

3

1.3- Tac dung

5

1.4- Cụng dung

7

V 1.5- Dinh lirỗmg

8

1.6- Che bien

9

1.6.1 - Mue dợch che bien thuoc co truyờn

9

1.6.2 - Cõc phifcfng phõp che bien thuoc co truyờn

9

vi thuoc.
2.2.2 - Nghiờn cỹu su bien doi alcaloid ụ cõc MNC

16
16


2.2.3 - Nghiên cûu mot so tâc dung sinh hoc
2.3 - Bàn luân

31
36

2.3.1 - Phicong phâp dinh hcçfng alcaloid trong Hoàng lien

36

2.3.2 - Ânh huông nhiêt dô tâi thành phàn hoâ hoc

37

2.2.3 - Tâc dung sinh hoc

37

PHAN 3: KÉT LUÂN VÀ DE XUAT
3.1 - Ket luân

39
39

g(mg)/KgT.T :

g(mg) duoc liêu/Kg thé trong suc vât thf nghiêm

HPLC :

Sâc kÿ long hiêu nâng cao

MeOH :

Methanol

MNC :

Mâu nghiên ciïu

Pal :

Palmatin

SKLM :

Sâc kÿ lorp mông

t°:

Nhiêt dô

t:



PHAN 1: TÔNG QUAN
1.1- DÂC
DIÊM THÜC
VÂT:
•
•
•
C6 nhiêu loài Hoàng liên chân gà:
Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y. Cheng,
Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao. Ho Hoàng liên (Ranunculaceae).
Hoàng liên là cây thâo sô'ng nhiêu nâm cao chùng 1 5 - 3 5 cm, thân moc
thang phfa trên phân nhânh, co nhiêu rê nhô. La moc so le tir thân rê lên, cuong
la dài 6 - 12 cm. Phién la gôm 3 - 5 la chét, môi la chét lai chia thành nhiêu thùy
mép cô nhüng rang ara [3, 2, 6, 7, 9, 12].
Cây thuông ra hoa vào mùa xuân. Hoa co 5 la dài màu vàng lue, cânh hoa
hïnh müi mâc dài bàng 1/2 la dài, co nhiêu nhi dài bàng cânh hoa. Quâ dai co
cuong trong chtra 7 - 8 hat màu xâm.
Hoàng liên thucmg moc à vùng nui cao 1500 - 2500 m. Cây ua noi mât am
thâ'p nhiêt dô 20 - 25 °C, dât dê thâo nuôc [3, 7, 9]. Hoàng liên trong bàng hat,
thucmg trong vào mùa xuân [2, 7].
Thu hâi Hoàng liên vào cuôi mùa thu dàu mùa dông thâng 9 - 1 0 [3, 7, 12,
17, 24], néu là cây trong thï thu hâi sau 4 - 5 nâm. Hoàng liên moc hoang và
trong nhiêu à Trung Quôc (TûXuyên, Hô Bac). Ô Viêt Nam, Hoàng liên moc
hoang trên dây nui Hoàng liên Son (Sapa cô Coptis quinquesecta Wang, ô Quang
Ba- Hà Giang cô Coptis chinensis Franch) [3,2,12].
- Bô phân dùng:
Bô phân dùng cüa Hoàng liên là thân rê, dô là nhüng mâu cong queo dài tù
3 cm trô lên, rông 0,2 - 0,5 cm. Cô nhiêu dot khüc khuÿu, phân nhânh nhiêu
giông hînh chân gà nên côn goi là Hoàng liên chân gà. Mât ngoài thân rê màu

cây. Hàm luong Ber trong thân rê cao nhât vào thâng 9 -1 0 , thâp nhât vào thofi kÿ
cây ra hoa. Trong la cüng cô Ber, à la già hàm luçmg Ber cao nhât vào thâng 7 10 khoâng 2,5 - 2,8 % [3, 20]. Ô hoa và hat cüng chüa 1 luong nhô Ber: hoa 0,56
%, hat 0,23 %.
Ngoài Alcaloid trong thân rê Hoàng liên côn cô tinh bot, acid hùu co nhu
acid ferulic [3].

3


Công thuc eau tao cüa mot so Alcaloid trong Hoàng liên:
Jatrorizin

=

- H
r 2= - c h 3

R {=

Berberin

Ri + ~ ■CH2-

Palmatin

R, +R2 = - CH 3

Coptisin

R - - H


Ber dang base

144 °C

354, 278, 218

Ber dang nitrat ( N+)

205 °C

350, 264, 228

Ber clorid
Pal dang nitrat ( N+)

427, 349, 266, 230
192 °C

Pal clorid

340, 270, 224
430,348,267,227

D- tetrahydro Pal

142 °C

L- tetrahydro Pal


Mot sô vi khuân Staphylococus aureus, Streptococus hemolyticus dê khâng
thuoc vôi Ber sulfat nhung vôi bài Hoàng liên giâi dôc thang lai khô sinh ra tînh
chat khâng thuôc [4, 20].
❖ Tâc dung chong viêm:
Do Ber cô tâc dung \xc ché giâi phông acid arachidonic tir màng té bào, giâm
luong prostaglandin (PGI2) trong huyét tUdng [22], ûc ché hïnh thành u hat trên
suc vât thuc nghiêm.
❖ Tâc dung trên tim:
Ber làm giâm su co that cüa tim, làm giâm nhip tim trên chuôt thuc nghiêm [22].
Fang cho ràng vôi liêu lmg/kg trên mèo thî nghiêm, Ber làm giâm co co tâm
thât. Ber cô tâc dung chông loan nhip tim, duoc xép vào nhôm thuôc dô'i khâng
canh tranh vôi hê a , , a 2 adrenergic [20].
*X* Tâc dung ha huyét âp :

5


Do lm dõn mach [3,6] thuụng dựng dộ phong ngựa xỹ vỷa dụng mach, do Ber
lm giõm luỗmg cholesterol trong huyột tuong [20].
Vụi dudng tiờu hoa:
Hong liờn vụi liờu nhụ kich thich giỷp su tiờu hoa tng co bụp da dy, ruụt,
chỷa viờm da dy [3,6,12].
Tõc dung khõng virỷt cỷm [4,6,20] :
Nuục sc Hong liờn vụi nụng dụ 50% nghiờn cỷu trờn phụi g cụ tõc dung ỷc
chờ su phõt triởn cua virỷt cỹm chung PR8, 56S8 P.M [20].
Ba Protoberberin alcaloid tự dich chiột Hong liờn cụ tõc dung ỷc chộ
monoamino oxydase (MAO), riờng Jatrorrhizin ỷc chờ' khụng canh tranh cõ
MAOA v MAOB (ụ ti lap thộ nõo chuụt cụng trõng) vụi giõ tri IC50 l 4pM v
62 (J.M. Cụn Ber chợ ỷc chộ canh tranh vụi MAOA vụi IC50 l 126 p,M trong khi
Pal vụi IC5() = 200jiM cỹng khụng ỷc chộ 2 enzim ny [23].

*Theo y hoc co truyờn, Hong liờn cụ tõc dung thanh nhiờt tõo thõp, thanh
nhiờt tõ hụa [2,4].
*Hong liờn cụ vi dng, tmh hn, quy vo nm kinh: tõm, t, vi, can, dai
trng [4, 5 ,7, 20]
* Cụng nõng chỹ tri:
Thanh nhiờt tõo thõ'p:diờu tri li, viờm ruụt. Hong liờn cụ tmh khõng
khuan manh phộ rụng nờn dựng dộ tri li amip, li truc khuan [3,4, 24].
Thanh tõm trựphiờn: dựng dở diờu tri chựùùg tõm hụa thinh gõy ra hụi
hụp mõt ngỹ, bon chụn, niờm mac luụi miờng phụng dụp [4,24].
- Thanh can sang mõt: tri chiùng can hụa gõy ra dau mõt dụ , sot cao
xuõt huyột hong dõn , diờn cuụng phõ phõch ( can hoõ vuang ) [2, 7 ].
Chi huyờt: dựng cho truụng hap huyột nhiờt dõn dộn chõy mõu cam,
non ra mõu [4, 6].
Gidi dục ha hụa: diờu tri ung nhot dục bờn trong, sot cao mờ sõng
phõt cuụng [4, 6].
Trong dõn gian thung dựng dich nuục sc Hong liờn dở tri chỷng dau mat
dụ, dựng ngoi dở tri nam ngoi da, eczema, viờm tai giỷa cụ mỹ [3,24] bụi
ngoi diờu tri trờ em tua luụi ,sung luụi ,viờm miờng , lụ mụi [7].
Can chu y; Hong liờn vi rat dng khụng nờn dựng liờu cao kộo di dở gõy
non, liờt thõn kinh vi giõc, ton thuang dich vi, õn khụng biột ngon [4].

7


1.5- DINH LĩONG ALCALOID:

De dinh luỗmg Alcaloid trong Hong liờn cụ nhiờu phuong phõp:
Dinh luong bng phiùỹng phõp cõn [3,5,11 ]
Nguyờn tõc: Chiột alcaloid trong duoc lieu bng cụn, kột tỹa Ber bng dung
dich Kl, thờm aceton, kiờm hoa bng amoniac de tao tỹa phỹc. Loc ly tỹa sy

> Giâm tâc dung không mong muôn, thay doi tâc dung cüa thuôc, vî
du: Hà thü ô ché vôi dàu den dë giâm anthranoid, giâm tâc dung nhuân tay [4,

12].
> Giüp bâo quân thuôc tôt hon: làm on dinh duoc lieu trânh nam môc,
vî du Hoè hoa trong diêu kiên am, men rutinase phân huÿ rutin thành queexetin
làm hoè bi xâm di [4, 12].
> Làm thay doi tmh vi quy kinh cüa thuôc tù dô làm thay doi tâc
dung cüa thuôc, vî du: Sinh dia vi dang tmh hàn, tâc dung thanh nhiêt luong
huyét, sau khi ché vôi sa nhân, gùng, ruou duôi tâc dung cüa nhiêt trü thành thuc
dia vi ngot tînh ôn cô tâc dung bo huyét ; hoàng kÿ trîch mât tàng quy kinh tÿ ,
tâng tâc dung bo khî [4, 7, 12].
> Làm tâng tâc dung cüa thuôc do làm giâm dô bên co hoc, tâng khâ
nâng giâi phông hoat chat, làm mât mot sô thành phân không can thiét, sinh ra
mot sô thành phân moi cô tâc dung diêu tri bênh. Vî du thâo quyét minh vi sao
cô tâc dung nhuàn tây , sao vàng cô tâc dung nhuân ha, ha âp, sao chây cô tâc
dung an thân [4]
1.6.2. Câc phuong phâp ché bién thuoc co truyên:
Cô ba phuong phâp co bân ché bién thuôc co truyên: hoâ ché, thuÿ ché, thuÿ
hoâ hop ché [4, 12].
♦> Hoâ che: là phuong phâp ché bién chî dùng lüa, nhàm mue dîch:
- Giâm dôc tînh, giâm tâc dung quâ manh cüa vi thuôc.
- On dinh hoat chât trong vi thuôc.
- Giâm dô bên co hoc cüa vi thuôc.
Câc phuong phâp hoâ ché duoc ghi à bâng 1.2

9


Bàng 1.2: câc phuong phâp hoâ ché.

Màu vàng, canh
màu den chây

Giâm bot mùi vi khô chiu

100 -140

Vàng

Cân bàng âm dueng cho vi thuoc

180 - 240

Sao chây

180-240

Sao câch cât

200 - 250

Sao

Sao câch
câm
Sao câch
hoat thach
hoac van
câp


thuôc.
Tàng tâc dung kiên tÿ, giâm tmh khô
tâo cüa vi thuôc
Trânh két dmh thuôc

200

Nung

Hàng
nghin

Ché sirang

Hàng
nghln

Vô ca hoâ, phâ vô câu truc cüa thuôc
Tinh ché thuôc cô nguôn khoâng vât,
à nhiêt dô cao câc hoat chat thàng hoa
tâch ra khôi tap
Giâm bôi chat dàu trong vi thuôc,
giâm tmh kich ufng cüa vi thuôc
Làm chin, giâm tmh mânh liêt cüa vi
thuôc
Làm thay doi tmh chat vi thuôc loai
trîr nuôc trong câu truc phân tu tàng
khâ nàng hüt nuôc làm sàn se

Lùi

chộ giõm cụ tõc dung loi mõt tụt hon cõ Hong liờn trich gựng [1]
1.7 NHN XẫT CHUNG:
Viờc chộ biộn lm õnh huụng rõ't nhiờu tụi tfnh chat cỷa vi thuoc, qua
chộ biộn tõc dung cỹa vi thuoc cỹng thay doi. Do dụ cõn nm chc duoc quy
luõt cỹa chộ biộn dộ tao ra nhỹng tõc dung diờu tri bờnh theo y muụn chỹ
quan. De tõng giõ tri su dung cỹa vi thuoc cõn lua chon nhỹng phuong phõp
chộ biộn phự hop.

11


PHAN 2: THĩC NGHIấM V KấT QU
2.1- NGUYấN LIấU PHI/NG TIấN, PHI/ONG PHP NGHIấN CĩU:
2.1.1 Doi ttrong nghiờn cuti:
Chỹng tụi tien hnh nghiờn cỹu trờn thõn rờ cõy Hong liờn (Rhizoma
Coptidis) thuục chi Coptis ho Ranunculaceae. Mõu lõy tai Sapa thõng 9/2002.
2.1.2 Thiột b i, hoõ chat ,suc võt thợ nghiờm .
- Tỹ sõy: Memmert, SHELLAB
-

May xõc dinh dụ õm Prộcisa HA60 (Thuy Sù)

-

Cõn phõn tợch

- Bụ Shoxhlet 150 ml
- May sõc k long (HPLC) Thermo Finnigan.
- Dung eu thỹy tinh.
- Chat chuõn: Ber clorid, Pal sulfat do Viờn Duỗfc lieu cap

* Nguyên tac:
Dich chiét duoc liêu duoc tiêm vào côt sàc kÿ và duoc pha dông chay qua
côt tâch thành câc Alcaloid riêng biêt. Môi Alcaloid ra khôi côt duoc detector
UV nhàn biét, biëu hiên ra bàng môt pic. Diên tich pic tî le thuân vôi nông dô
dung dich Alcaloid.
* Tmh két quâ theo công thuc (1)
X%

cc.sTvc y

= --------—7----- r—.100
mO.Sc VT.rn.(\-a)

(1)

X: hàm luong hoat chat (%)
Cc: nông dô hoat chat dich chuân tiêm sàc kÿ (mg/ml) (Berberin , Palmatin)
Vc: thë tfch tiêm mâu chuân (|j,l)
VT: thë tich tiêm mâu thü (|j.l)
V : thë tich dich chiét thu duoc (ml)
Sc: diên tich pic chat chuân
Sj'. diên tfch pic chat thü
m: khôi luong duoc liêu chiét (g)
a: hàm âm cüa duoc lieu (%)
So sânh diên tich pic cüa Ber, Pal trong mâu thü vôi diên tich Ber, Pal trong
mâu chuân tù dô suy ra hàm luong Ber, Pal trong duoc liêu theo công thüc (1).

13



X =

14


t = L ? L ztL

(2)

J n -1
So sânh t vôi ta n tra trong bàng
+ Néu t > ta n : so b là sai so thô , loai bô
+ Nëu t < ta n : so b không phâi sai s6 thô , giù la i.
■ Thôi gian ngü cüa chuôt duoc tmh theo công thuc:
y/n
Trong dô:
X : khoâng tin cây
X : trung bînh công thôi gian ngü cüa lô thü.
S: dô lêch chuân:
S

=
n(n-1)

t0: thay doi tuÿ theo bâc tu do cüa mâu phu thuôc vào xâc suât p cüa
phép tînh. à dây ta xü lÿ két quâ vôi p = 0,95 (95%)
■ Dë kiëm tra hai mâu thü cô thuc su khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê
không, phâi dùng chi tiêu kiëm dinh Test t, tînh theo công thuc:
_


> Néu:
t > t0 thi hai mâu khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%.
t < t0thî hai mâu khâc nhau không cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%.
2.2 . K ÉT QUA THlTC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT.
2.2.1.Theo dôi ânh huông cüa nhiêt dô den sir doi màu cüa vi thuôc.
Thân rë Hoàng liên duoc tâch nhô, bô rê con, rüa sach phüi khô thâi phiên
chéo dây 2 - 4 mm, tan thành bôt thô.
Sây bôt thô duoc liêu ô câc müc t° khâc nhau trong khoâng thôi gian khâc
nhau (10 20 30 ’). Su dôi màu cüa vi thuôc duoc ghi à bâng 2.3.
Bàng 2.3: Su chuyén màu cüa vi thuoc Hoàng liên khi sây â nhiêt dô khâc nhau.
t sây
t°
(°C)

Màu cüa câc MNC
10

100
110
130
140
150
160
180
200
220
Nhân xét:

20
Vàng

liêu sông.
> Câc mâu 140°C / 30 ; 150° / 10’, 20, 30 : câc mâu cô màu vàn
dâm, tuong duong vôi sao vàng.
> Câc mâu 200°C / 10’, 20, 30 ; 220°C / 10’, 20, 30 cô màu den
tuong duong sao chây.

16


2.2.2. Nghiờn cỷu sir bien doi alcaloid cõc MNC
2.2.2.I. Chiột xuõt alcaloid
Dựng phuong phõp chiột bng acid loõng trong MeOH [13]
So dụ chiột alcaloid duoc mụ tõ hợnh 2.1
Hinh 2.1: Sa dụ chiột xuõt alcaloid trong cõc MNC

Cõn chmh xõc 1 luong MNC theo bng 2.7. Chiột bng shoxhlet vụi dung
mụi MeOH: HCl ( 100 : 1), chiột tụi khi dich chiột khụng cụn tua vụi thuục thỹ
Mayer, Dragendorff. Cõt thu hụi MeOH trờn nụi cõch thu. Cõn alcaloid duoc
chiột bng nuục nụng 3 lõn, mụi lõn vụi 20 ml. Loc. Cụ cõch thu dich loc tụi
can. Cõn duoc ho vo MeOH, chuyởn vo binh dinh miic 50 ml, thờm MeOH tụi
vach. Duoc dich alcaloid (A).
2.2.2.2. Dinh tợnh alcaloid
*t* Dinh tinh bng thuoc thỹ chung:
Chiột xuõt alcaloid cỹa cõc MNC theo mue 2.2.2.1.
Dich (A) duoc dinh tmh bng cõc TT: Mayer, Dragendorff, Bouchardat.
Lõy 1 ml dich (A) cho lõn luot vo cõc ụng nghiờm, nhụ vo mụi ụng nghiờm 1
- 2 giot TT.
TT Mayer: phõn rùng duong tmh (+) khi xuõt hiờn tỹa trang.
TT Dragendorff: phõn ỷng duong tmh (+) khi xuõt hiờn tỹa vng cam.
TT Bouchardat: phõn ỷng duong tợnh (+) khi xuõt hiờn tỹa nõu.

B

P

R

S

z

150° 160° 160° 160° 180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220°
30'

10’ 20’

30’ 10’

20’

18

30’

10’ 20’

30’ 10’ 20’

30’




O

130
10'

O

130
20'

O

130
30’

B

P

R

140° 140° 140° 150° 150° 150° 160° 160° 160°
10’ 20' 30’ 10’ 20' 30' 10' 20' 30'

BP

R

R : Rotundin chuân


0,61

X

0,68

P

+

Sông

R

++

+

100°C

110°C

130°C

140°C

150°C

160°C


+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+


++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++


+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+++

++


+

Bàng 2.5: Két quâ phân tich alcaloid bàng SKLM
( hiên màu bàng TT dragendorff )
Rf

Chat chuan
B

1

0,42

2

0,52

3

0,61

X

0,68

4

0,70


30’

++

++

+

+

+

+

+

+

++

+++

+++

+++

+++

+++