i

LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài. Cuối cùng đồ án tốt nghiệp cũng đã hoàn
thành. Lời đầu tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu và các Phòng Ban Trường Đại Học
Nha Trang cùng toàn thể các thầy cô đang công tác tại trường lời chúc sức khỏe và niềm
tự hào khi em được học tập trong ngôi trường này.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã
truyền đạt kiến thức quý báu để em có thể hoàn thành tốt đề tài.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất đến thầy TS. Huỳnh
Nguyễn Duy Bảo đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em có thể hoàn thành bài
báo cáo tốt nghiệp này.
Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ Chế biến Thủy sản,
Công nghệ Thực phẩm, phòng Hóa sinh-Vi sinh, phòng Hóa phân tích và phòng Công
nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị khóa trên
đã động viên góp ý giúp em hoàn thành đề tài này.
Nha Trang, ngày 14 tháng 3 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Phan Tấn Quyền


ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................i
MỤC LỤC .................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. v


1.2.1.

Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới............................................. 12

1.2.2.

Tình hình nghiên cứu hải miên tại Việt Nam ........................................... 14

1.3.

Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa ....................................................... 14

1.3.1.

Quá trình oxy hóa ..................................................................................... 14

1.3.2.

Chất chống oxy hóa .................................................................................. 17

1.3.3.
biến

Một số phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ
19

1.4.

Hoạt chất sinh học chống oxi hóa từ hải miên ................................................ 20

Nhóm hợp chất glycoside ......................................................................... 22

1.6.

Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học .............. 22

1.6.1.

Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction) ..... 22

1.6.2.

Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction) ..... 23

1.6.3.

Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) ..... 24

1.6.4.

Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao (Pressurised liquid extraction)
25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 27
2.1.

Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................. 27

2.1.1.


Phương pháp phân tích tổng năng lực khử ............................................ 35

2.2.2.3.

Phương pháp phân tích hàm lượng protein ........................................... 35

2.3.

Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .......................................................... 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 36
3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy
hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ................................................ 36


iv

3.1.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống
oxy hóa của dịch chiết từ hải miên ............................................................................ 36
3.1.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng protein
của dịch chiết từ hải miên ......................................................................................... 40
Kết quả ...................................................................................................................... 40
3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng
chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .............................. 43
3.2.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên ................................................................. 43
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên được đánh giá dựa trên khả năng 43
3.2.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng
protein của dịch chiết từ hải miên ............................................................................. 47
Kết quả ...................................................................................................................... 47

PL: Pha loãng
ĐLC: Độ lệch chuẩn


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Loài Gellius varius ......................................................................................... 3
Hình 1.2: Loài Dysidea cinerea...................................................................................... 3
Hình 1.3: Loài Haliclona sp............................................................................................ 4
Hình 1.4: Loài Mycale plumosa ..................................................................................... 4
Hình 1.6: Loài Amorphinopsis excavans ........................................................................ 5
Hình 1.7: Loài Cirathria vulpina .................................................................................... 6
Hình 1.8: Loài Petrosia nigricans .................................................................................. 6
Hình 1.9: Loài Xestospongia testudinaria ...................................................................... 7
Hình 1.10: Loài Niphates sp ........................................................................................... 7
Hình 1.11: Loài Styirissa flabelliformis.......................................................................... 8
Hình 1.12: Loài Ianthella sp ........................................................................................... 8
Hình 1.13: Loài ircinia sp .............................................................................................. 9
Hình 1.14: Gốc tự do .................................................................................................... 15
Hình 1.15: Nguồn gốc hình thành gốc tự do ................................................................. 16
Hình 1.16: Chất chống oxi hóa ..................................................................................... 18
Hình 2.1: Loài hải miên Spongia sp lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc ........................... 27
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết chất chống oxy hóa từ Hải miên............. 28
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi có hỗ trợ siêu âm đến
khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ................... 31
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi không có hỗ trợ siêu âm
đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên............. 34
Hình 3.1: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được
chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b)

bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05). ..................................................................................................... 48
Hình 3.7. Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein có hỗ
trợ siêu âm của (a) dịch chiếthải miên lần 1(b) dịch chiếthải miên lần 2 (c) dịch chiếthải
miên lần 3 (d) dịch chiếthải miên tổng 3 lần chiết ........................................................ 51
Hình 3.8. Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein không
có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch
chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. ....................................... 52


viii

Hình 3.9. Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm
của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần
3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. .................................................................. 524
Hình 3.10. Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein không có hỗ trợ
siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải
miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. .................................................... 525
Hình 3.11. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được
chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước
cất; (b) dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên
đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)...................................................................... 56
Hình 3.12. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất
với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước cất; (b)
dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên đồ thị là
giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). .................................................................................... 57
Hình 3.13. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất
với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng các dung môi khác nhau. Số

hải miên ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa tận dụng được hết nguồn tài nguyên


2

biển vô cùng quý giá. Để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên quý giá này, việc nghiên
cứu tách chiết các hoạt chất sinh học từ hải miên là rất cần thiết và đó là lý do tôi chọn
đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết và siêu âm đến hoạt tính chống
oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên”.
Mục đích và ý nghĩa của đề tài:
Mục đích đề tài:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxi hóa và
hàm lượng protein của hải miên.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng
protein của hải miên.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn:
+Là cơ sở để lựa chọn dung môi và phương pháp chiết thích hợp.
+Thành công của đề tài sẽ tạo ra chất chống oxi hóa ứng dụng trong y học
Trong quá trình thực hiện đề tài này mặc dù đã cố gắng hết mình tìm hiểu, song
do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế cũng
như khó khăn về điều kiện thực nghiệm, vì vậy những sai sót mắc phải là điều không thể
tránh. Kính mong sự chỉ bảo của quý thầy cô cũng như ý kiến đóng góp của các bạn sinh
viên để đề tài được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.


Hình 1.4. Loài Mycale plumosa
+Loài Ircinia echinata, thuộc họ Irciniidae
Mô tả: Thường sống dạng khối có xẻ thuỳ, bề mặt được bao phủ bởi các mấu nhỏ,
thường có màu nâu đen cho tới màu đen, cơ thể dẻo và đàn hồi giống như cao su


5

Hình 1.5. Loài Ircinia echinata
+ Loài Amorphinopsis excavans, thuộc họHalichondriidae
Mô tả: Đây là loài đục lỗ vào trong các khối san hô hoặc nền đáy và chiếm cứ gần
hết không gian bên trong, màu sắc thay đổi từ vàng cho tới vàng đâm, có lỗ mở trên bề
mặt khá lớn. Khi để khô thường chuyển màu trắng ngà

Hình 1.6. Loài Amorphinopsis excavans
+ Loài Cirathria vulpina,thuộc họMycalidae
Mô tả: Cơ thể dạng cành, có màu vàng cam, bề mặt xù xì được tạo nên bởi nhiều
núm gai nhỏ


6

Hình 1.7. Loài Cirathria vulpina
+ Loài Petrosia nigricans, thuộc họ Petrosiidae.
Mô tả: Thường có dạng khối, giống hình núi lửa, cấu trúc cứng và dễ vỡ, dễ gãy,
bề mặt tương đối nhẵn, thường có màu tím nhạt cho tới nâu đâm.

Hình 1.8. Loài Petrosia nigricans
+ Loài Xestospongia testudinaria, thuộc họ Petrosiidae


9

Hình 1.13. Loài ircinia sp
1.1.2. Đặc điểm sinh học của hải miên
Hải miên là động vật đa bào thấp, không tương đồng với cấu tạo cơ thể của các
nhóm động vật đa bào khác: Cơ thể chưa có kiểu đối xứng ổn định, chưa có lỗ miệng,
chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh.
Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người
ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất (Chairman và cộng sự, 2012).
Phần lớn hải miên sống ở biển, chỉ có khoảng 150 loài sống ở nước ngọt. Màu
sắc, hình dáng và kích thướt của cơ thể khác nhau tùy loài. Từ vài mm tới vài mét. Thân
lỗ là nhóm sống bám tuy cũng quan sát thấy vài loài có thể di chuyển chỗ vài mm sau
mỗi ngày, có thể do vận động của tế bào chất hoặc tế bào amip.
Hải miên ăn bằng cách lọc. Hầu hết hải miên ăn các hạt hữu cơ nổi và sinh vật
phù du nhỏ mà chúng lọc được từ các dòng nước chảy qua cơ thể của chúng. Nước đưa
thức ăn và O2 vào cơ thể qua lỗ hút nước và theo ống dẫn nước trong thành cơ thể vào
khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài.
1.1.3. Hình thức sinh sản của hải miên
Có hai hình thức sinh sản: Vô tính và hữu tính
Sinh sản vô tính bằng mọc chồi hoặc tạo mầm chồi đó là những múm nhỏ mọc
trên thành cơ thể. Mầm là khối tế bào amip được một lớp vỏ kép cách nhiệt bọc ngoài.
Sinh sản hữu tính: Phần lớn thân lỗ lưỡng tính. Tế bào sinh dục do tế bào amip
hoặc tế bào cổ áo tạo thành, chúng ở tầng keo và nằm dưới các phòng roi, tinh trùng chin


10

lọt vào phòng roi theo dòng nước thoát ra ngoài, rồi tới thụ tinh noãn của một cá thể
khác.

Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên, với sự hiện diện của các chất chuyển hóa
thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên. Các chất
chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên, với nhiều chất chuyển hóa
có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào , chống viêm và hoạt
tính kháng virus. Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành công nghiệp dược
phẩm để tạo ra các loại thuốc mới.
Vidarabine, một loại thuốc chống virus (dùng để chống lại các loại virus viêm
não Herpes simplex), và Ara-C, một loại thuốc chống ung thư, cô lập khỏi hải
miên Tethya crypta. Cả hai hợp chất được sử dụng lâm sàng trong nhiều năm.
Halichondrin B được phân lập từ loài hải miên Halichondria okadai, nhưng cũng
đã được tìm thấy trong các loài hải miên Lissodendoryx. Các hợp chất đã được đánh giá
hoạt tính chống ung thư. Một chất tổng hợp của chúng được gọi là E7389, hiện đang
trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh ung thư phổi.
Discodermolide, được tìm thấy trong các loài hải miên Discodermia dissolute,
chúng đang trong các thử nghiệm lâm sàng đối với các khối u rắn.
Agelasphins từ loài hải miên mauritianus Agelas có hoạt tính chống ung thư và kích
thích miễn dịch. Hiện trong các thử nghiệm lâm sàng cho điều trị miễn dịch ung thư.
Psammaplin A là một hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong loài hải miên
Psammaplysilla. Nó là một cấu trúc dẫn cho các hợp chất chống ung thư tổng hợp NVPLAQ824 và cho kháng sinh chống lại các vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Contignasterol được phân lập từ các loài hải miên Petrosia contignata. Các dẫn
xuất tổng hợp của hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh hen suyễn
và viêm da và mắt Newman &Cragg (2004).
1.2.

Tình hình nghiên cứu hải miên


12

Hải miên (Porifera) là nhóm sinh vật đa bào nguyên thủy có cấu trúc cơ thể khá

Mẫu vật được thu thập trong các cuộc thám hiểm của các nhà khoa học Châu Âu,
các mô tả đã chi tiết hơn như: Carter, 1883,1887 nêu về sự phân bố và các kiến thức về
hải miên, trong khoảng thời gian 1873-1876 có cuộc hành trình vòng quanh thế giới của
tàu Challenger, trên tàu tập hợp đông đảo các nhà khoa học lúc bấy giờ. Mẫu vật thu
thập được trong chiến hành trình này cung cấp khá nhiều thông tin cho các nhà khoa học
và một loạt các báo cáo khoa học đã được công bố sau hành trình của tàu Challenger
điển hình là các báo cáo như sau: Polesjaef , 1884 công bố về thành phần loài hải miên
đá vôi Calcarea thu thập được trong chuyến hành trình. Ridley và Dendy, 1886,1887
công bố về nhóm hải miên Monaxonida; Sollas, 1886, 1888 công bố về nhóm hải miên
Tetractinellidae ; ngoài ra còn có các công trình công bố khác như của Lindgren,
1897,1898 công bố về khu hệ hải miên tại quần đảo Malaysia; Topsent, 1897 công bố
những nghiên cứu về hải miên tại vịnh Amboine; Sollas, 1902 công bố về hải miên tại
vùng biển Malaysia; Vosmaer, 1902 mô tả chi tiết mới Placospongia và Spirastrella tại
vùng biển Siboga; Wilson, 1925 công bố về nhóm hải miên silic thu thập trong chuyến
thám hiểm tại quần đảo Philipin; Ijima, 1926 công bố về thành phần loài của hải miên
Hexactinellida báo cáo tình hình mẫu vật về Hải miên sống tại các vùng nước nông và
các vùng nước sâu trong bảo tàng Ấn Độ; De Laubenfels, 1935 công bố về các nghiên
cứu về hải miên thu thập từ Puerto Galera Mindoro, Philipin.
Giai đoạn 3: Từ cuối thế kỷ 20 đến nay
Có rất nhiều mẫu vật được thu thập nhưng phần lớn các mẫu vật trên vẫn chưa
định loại chính xác hoặc chưa định loại được, phần lớn các nghiên cứu đã chuyển sang
nghiên cứu về các cơ chế trao đổi chất của hải miên, các công trình về định loại còn lại
rất ít tiêu biểu là: Caberoy, 1979, 1981; Caberoy & Tahil, 1983 công bố nghiên cứu về
khu hệ hải miên tại Philippin (vịnh Tayabas); Esmero, 1978; công bố về thành phần loài
hải miên vùng triều sống trên các giá thể nhân tạo tại cảng Cebu - Philippin; Levis C.,
1961 công bố nghiên cứu về hải miên tại vùng biển Nha Trang Việt Nam và vùng biển
Philippin; Pulitzer-Finali, 1980 nêu một số nghiên cứu về hải miên tại các vùng nước


14

1.3.1. Quá trình oxy hóa
Sự oxy hóa là một quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ thể sinh ra các gốc tự do khi
có mặt của oxy phân tử.


15

Hình 1.14. Gốc tự do
Theo định nghĩa, gốc tự do ( Free radical) là bất cứ phân tử hóa chất nào chỉ có
một điện tử duy nhất ( electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử.
Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở
thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên rất bất ổn,
dễ tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân
tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh học bình
thường của tế bào.
Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn sẵn sàng
thực hiện oxi hóa, nhận điện tử của chất mà nó tiếp xúc (để ghép đôi với điện tử độc thân
của nó) và làm chất bị nó oxy hóa bị hủy hoại nặng nề.
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại Học Berkeley, California, là
khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ
gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ
có ở ngoài cơ thể.
Tia tử ngoại, môi trường ô nhiễm, stress, chất phụ gia trong thức ăn, các chất
có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, uống rượu quá đà, lạm dụng dược phẩm... là những
tác nhân chính gây ra gốc tự do.


16

Hình 1.15. Nguồn gốc hình thành gốc tự do