BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC HẠNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT
FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN
NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I

HÀ NỘI 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC HẠNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT
FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN
NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I
CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ:

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện:Trường Đại Học Dược Hà Nội
Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa
Thời gian thực hiện: 15/01 – 19/5/2015



AFTA

Khu vực mậu dịch tự do Asean

BYT

Bộ Y tế

CP

Dược điển Trung Quốc

DĐVN

Dược điển Việt Nam

EP

Dược điển Châu Âu

HD

Hạn sử dụng

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MeOH


TT

Thông tư

USP

Dược điển Mỹ

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại khả kiến

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

WTO

Tổ chức thương mại thế giới


MỤC LỤC
MỤC

TRANG

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

1.3.1. Khái niệm chung

9

1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký

9

1.3.4.Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm nghiệm
thuốc

13

1.4. Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC

14

1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

14

1.4.2. Độ đặc hiệu/chọn lọc

14

1.4.3. Độ tuyến tính

15

1.4.4. Độ đúng


19

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU

20

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp
định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc

21

viên nang bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích định tính, định lượng đã
xây dựng
2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng kiểm nghiệm một số
mẫu thuốc viên nang Flunarizin lưu hành trên thị trường

22

24

2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

24


30

3.2.5. Độ chính xác

32

3.2.6. Độ đúng

35

3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THUỐC THU
THẬP TRÊN THỊ TRƯỜNG
3.3.1 So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp đã
đăng ký trong TCCS (phương pháp đo quang, kèm chất chuẩn)
3.3.2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích một số mẫu
nghiên cứu

37

37

39

Chương 4. BÀN LUẬN

42

4.1 VỀ XÂY DỰNGPHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

41


DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 1.1: Một số điều kiện định lượng hoạt chất Flunarizin

7

Bảng 2.1: Danh sách các mẫu phân tích

18

Bảng 2.2. Thành phần tá dược trong các chế phẩm thuốc viên
nang Flunarizin sản xuất trong nước.

20

Bảng 2.3. Công thức bào chế mẫu Placebo

21

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký

26

Bảng 3.2. Kết quả thẩm định độ thích hợp của hệ thống sắc ký.

28



DANH MỤC CÁC HÌNH

TÊN HÌNH

TRANG

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Flunarizin

4

Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Flunarizin.

29

Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử Flunarizin.

29

Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu Placebo.

30

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ
và diện tích píc flunarizin

31




1


Dược điển Trung Quốc (CP 2005) có một chuyên luận quy định về
chất lượng và phương pháp thử nghiệm cho thuốc viên nang Flunarizin với
chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
nhưng các điều kiện sắc ký chưa được chỉ rõ ràng dẫn đến sự lúng túng khi
tiến hành phân tích chất lượng mẫu thuốc (thiếu điều kiện về cột sử dụng
và tốc độ pha động) [14].
Trong tiêu chuẩn chất lượng của một chế phẩm thuốc chỉ tiêu định
tính và định lượng là những chỉ tiêu chất lượng quan trọng, luôn được quan
tâm xây dựng đảm bảo tính hiện đại, tiên tiến phù hợp đáp ứng yêu cầu của
sự phát triển khoa học công nghệ ngày nay.
Hiện nay kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao đã trở thành một trong
những kỹ thuật phổ biến, xuất phát từ những ưu việt của nó như: có độ
nhạy cao, đặc hiệu với từng hoạt chất, khoảng tuyến tính rộng, độ đúng
cao, độ lặp lại tốt đáp ứng yêu cầu của một kỹ thuật phân tích hiện đại.
Phương pháp đã được các phòng kiểm tra chất lượng của các công ty sản
xuất dược phẩm, các phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm triển
khai, áp dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu, thành phẩm sản xuất
thuốc và coi đây là phương pháp quy chiếu.
Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin trong thuốc viên nang
bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu:
1. Xây dựng và hoàn chỉnh phương pháp định tính, định lượng hoạt
chất cho thuốc viên nang Flunarizin và nghiên cứu thẩm định phương pháp
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng kiểm tra một số chế phẩm
thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam, đánh giá so sánh

áp dụng cho chế phẩm thuốc của chính nhà sản xuất đó, đơn vị có thẩm
quyền phê duyệt
+ Tiêu chuẩn DĐVN là tiêu chuẩn cấp nhà nước về thuốc khuyến
khích các cơ sở sản xuất thuốc trong nước áp dụng các tiêu chuẩn kỹ thuật
3


của chuyên luận thuốc đã được ban hành trong DĐVN, khi các cơ sở sản
xuất xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thì mức tiêu chuẩn không được thấp hơn
mức tiêu chuẩn đã quy định trong DĐVN. Đối với các thuốc nước ngoài
khi đăng ký nhập khẩu vào Việt Nam thì tiêu chuẩn kỹ thuật của sản phẩm
không được thấp hơn so mức tiêu chuẩn DĐVN nếu đã có chuyên luận của
chế phẩm đó.
Ngày nay cùng với sự hội nhập toàn cầu, Việt Nam tham gia WTO;
AFTA... các loại hàng hóa trong đó có thuốc chữa bệnh ngày càng phong
phú về chủng loại, dạng bào chế đã góp một phần quan trọng trong công
tác chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhân dân, song nếu hàng rào kỹ thuật của
chúng ta không tốt các sản phẩm thuốc nước ngoài có tiêu chuẩn chất
lượng không phù hợp dễ dàng tràn vào Việt Nam, bán với giá rẻ, các doanh
nghiệp sản xuất trong nước không đủ sức cạnh tranh ngay tại thị trường nội
địa, và người chịu thiệt thòi nhất là người bệnh, người tiêu dùng. Chính vì
vậy công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng phải luôn được quan
tâm đúng mức.
Trong những năm gần đây hàng loạt các văn bản pháp quy về dược
được ban hành trong đó quan trọng các văn bản sau: Luật Dược; Thông tư
09/2010/TT-BYT về quản lý chất lượng thuốc; thông tư 04/2010/TT-BYT
hướng dẫn lấy mẫu thuốc để kiểm tra chất lượng, thông tư 44/2014/TTBYT về đăng ký thuốc đã hoàn thiện dần hành lang pháp lý cho công tác
kiểm tra giám sát chất lượng thuốc dùng cho người.
1.2 Tổng quan về Flunarizin.
1.2.1 Cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa.

[14].

1.2.2.Tính chất dược động học, tác dụng dược lý
Dược động học
- Hấp thu: Flunarizin hấp thu tốt quan đường uống, đạt nồng độ đỉnh
trong vòng 2-4 giờ, và đạt trạng thái hằng định ở tuần thứ 5-6.
- Phân bố: phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô, gắn kết với
protein 90%.
- Chuyển hóa: Flunarizin bị chuyển hóa hoàn toàn qua gan
- Thải trừ: thuốc và các chất chuyển hóa được bài tiết ra phân qua đường
mật. Thời gian thải trừ hoàn toàn khoảng 18 ngày [5].

5


Tác dụng dược lý
- Flunarizin là thuốc có tác dụng ngăn chặn sự quá tải Calci tế bào,
bằng cách giảm Calci tràn vào tế bào một cách quá mức qua màng tế bào.
Thuốc không có tác dụng trên co bóp cơ tim và dẫn truyền co bóp cơ tim
[5].
Chỉ định
- Dự phòng đau nửa đầu dạng cổ điển (có triệu chứng báo trước) hoặc
đau nửa đầu dạng thông thường (không có triệu chứng báo trước).
- Điều trị chứng chóng mặt tiền đình do rối loạn chức năng hệ thống
tiền đình.
- Điều trị các triệu chứng do thiểu năng tuần hoàn não và suy giảm
oxy tế bào não bao gồm: chóng mặt, nhức đầu nguyên nhân mạch máu, rối
loạn kích thích, mất trí nhớ, kém tập trung và rối loạn giấc ngủ [5].
1.2.3 Tổng quan về các tiêu chuẩn kỹ thuật thuốc viên nang Flunarizin
DĐVN IV ban hành từ năm 2009 chưa có chuyên luận thuốc viên

Chuẩn
Nguyên
độ môi liệu
trường
Flunarizin
khan

UV-VIS

UV-VIS

UV-VIS

Các điều kiện phân tích

Nồng độ
mẫu phân
tích

Cân chính xác 0,2g chế
phẩm, hòa tan trong 15 ml
anhydric acetic, 10 ml acid
acetic băng, thêm 5 ml dung
dịch thủy ngân acetat (tt),
thêm 1 giọt tím tinh thể.
Chuẩn độ bằng Acid
percloric 0,1N đến khi xuất
hiện màu xanh.
Song song làm mẫu trắng.
1 ml acid percloric 0,1N


Viên nang Bước sóng λ=254 nm;
0,01 mg/ml
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,1N:

[6]

7


Kỹ
thuật
phân
tích

Nồng độ
mẫu phân
tích

Tài
liệu
tham
khảo

Viên nang Bước sóng λ=252 nm;
0,01 mg/ml
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,1N trong
Serapid

Pha động: MeOH : dung
dịch Đệm phosphat pH =
3,5 (75:25)
Detector: UV 253 nm
Thể tích tiêm mẫu 20 µl.

[14]

Thuốc viên
nén
hỗn
hợp
Flunarizin
và
propranolol

+ Cột: C8
+ Pha động: MeOH : dung
dịch đệm phosphat 10 mM
pH=3,8 (70 : 30);
+ Detector : 242 nm;
Nhệt độ cột 400C;
+ Thể tích tiêm mẫu : 20 µl;
+ Tốc độ dòng 0,8 ml/phút.

[19]

Thuốc viên
nang
Hagizine

khảo

amoni acetat + 1000ml
nước) : (30:30:40);
+ Detector : 253 nm;
Nhệt độ cột 400C;
+ Thể tích tiêm mẫu = 20
µl;
+ Tốc độ dòng 1,2 ml/phút.
1.3.Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid
Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa
tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.
Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các
chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Lựa
chọn thành phần pha động để chất phân tích ra khỏi cột được rửa giải với
thời gian hợp lý [10], [13], [18].
1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký
Thời gian lưu: Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào hệ thống sắc ký đến
khi chất phân tích được phát hiện tại detector.
Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của
nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM
Hệ số phân bố K:

K=

CS
CM


KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’A, k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
(tR)A, (tR)B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích
sắc ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α
quá lớn, thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết: Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột
sắc ký
2

 t 
L
t 
N   16 R   5,54 R 
H
W 
 W1 / 2 

2

L: chiều dài của cột (đơn vị độ dài);
H: chiều cao của đĩa lý thuyết (đơn vị độ dài);
W: chiều rộng của pic sắc ký (phút);
W1/2: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic.
10


Độ phân giải của cột
Độ phân giải (RS) đánh giá khả năng tách hai pic liền kề trong sắc ký đồ:

Dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:
- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:
11


 Gốc octadecyl (C18)
 Gốc octyl (C8)
 Gốc phenyl
- Pha tĩnh phân cực có R’ là:
 Cyano
 Amino
 Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai
loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như
triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như
hexan.
Sắc ký phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon
(C18 hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril.
Detector
Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và thường sử dụng 6 loại
sau:
- Detector hấp thụ UV-VIS
- Detector huỳnh quang
- Detector chỉ số khúc xạ
- Detector tán xạ ánh sáng bay hơi
- Detector đo dòng
- Detector đo độ dẫn

kỹ thuật: quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS; sắc ký bản mỏng (TLC);
phương pháp chuẩn độ hóa học để thực hiện các chỉ tiêu định tính, định
lượng, xác định tạp chất đến Dược điển Việt Nam IV đã chuyển sang kỹ
thuật HPLC. Điều này cho thấy rõ xu hướng phát triển và yêu cầu nâng cấp
tiêu chuẩn và khả năng ứng dụng của phương pháp HPLC.
HPLC giúp ta thực hiện phép thử định tính, định lượng và tạp chất
nhiều khi không cần xử lý.
13


Định tính Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc
ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử là cơ sở của phép thử định tính. Trên máy
HPLC hiện đại với Detector Diod array có thể quét phổ UV-VIS của pic
ứng với chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau
về hình dạng phổ thông qua hệ số match.
+ Hệ số match xấp xỉ 1,000 thì hai phổ định tính giống nhau hoàn
toàn.
+ Hệ số match > 0,900 thì hai phổ định tính tương tự nhau.
+ Hệ số match < 0,900 thì hai phổ định tính khác nhau.
Ngoài ra đối với Detector Photo Diod Array cò có thể kiểm tra được
mức độ tinh khiết của pic thông qua hệ số angel purity; threshold purity.
Định lượng Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và
pic thử (phương pháp chuẩn ngoại) hoặc tỷ lệ đáp ứng của pic chuẩn và pic
thử so với đáp ứng chuẩn nội (phương pháp chuẩn nội) trong cùng một điều
kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép thử định lượng. Khi mẫu thử là một
thuốc đa thành phần thì ta có thể định lượng đồng thời các thành phần hoạt
chất được tách ra đạt yêu cầu theo quy định.
Thử tạp chất Về cơ sở giống với phép thử định lượng. Ngoài ra đối
với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có
tạp chuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic tạp so với

giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất
phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.
Thường tiến hành ≥ 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của
phương pháp. Mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu.

Yêu cầu:
- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: Thu hồi 97,0 – 103,0 %; RSD ≤ 3,0%
- Tạp chất: phụ thuộc vào mức giới hạn.
15


Thu hồi 95,0 – 105,0 % hoặc 90,0 – 110,0% ; RSD ≤ 10 -15%(20%)
( Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)
1.4.5. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau
(mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được
chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra.
Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và
độ tái lặp.
Độ lặp lại
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành
trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại
biểu thị độ chính xác trong định lượng.
Thường được tiến hành trên 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ
3 lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%
Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0%
- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%