ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT
TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT
TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Hoàng Thọ Tín

Hà Nội – 2011

1.2.2.3. Tác dụng ............................................................................................ 15
1.2.2.4. Chỉ định ............................................................................................ 15
1.2.2.5. Chống chỉ định .................................................................................. 16
1.2.2.6. Chú ý khi dùng .................................................................................. 16
1.2.2.7. Tương tác thuốc ................................................................................. 17
1.2.2.8. Tác dụng phụ ..................................................................................... 18
1.2.2.9.Liều lượng .......................................................................................... 18
1.2.2.10.Quá liều ............................................................................................ 19
1.2.2.11.Bảo quản........................................................................................... 19
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam

19

1.3.1. Phương pháp quang học ........................................................................... 19
1.3.2. Phương pháp điện hóa .............................................................................. 21
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................... 21
1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) .............. 23
1.4. Một số phƣơng pháp xác định Cefaclor 24
1.4.1. Phương pháp đo quang ............................................................................. 24
1.4.2. Phương pháp điện hóa .............................................................................. 26
1.5. Giới thiệu về phƣơng pháp Von-ampe hòa tan (SV)

27

1.5.1. Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan ........................... 27


1.5.2.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan................................................. 33
1.5.2.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính ........................................ 33
1.5.2.2.Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP .................................................. 34

47

3.3.1. Khảo sát thế hấp phụ ................................................................................ 47
3.3.2. Khảo sát thời gian làm giàu ...................................................................... 49
3.3.3. Khảo sát thời gian cân bằng...................................................................... 54
3.3.4. Khảo sát tốc độ quét thế ........................................................................... 55
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung ...................................................... 57
3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của bước thế ............................................................. 59
3.3.7. Khảo sát tốc độ khuấy .............................................................................. 60


3.3.8. Khảo sát thời gian sục khí ........................................................................ 62
3.4. Xây dựng đƣờng chuẩn, đánh giá phƣơng pháp 64
3.4.1. Xây dựng đường chuẩn ............................................................................ 64
3.4.2. Khảo sát độ lặp lại và giới hạn phát hiện của phương pháp...................... 67
3.4.2.1. Độ lặp lại ........................................................................................... 67
3.4.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp ............. 69
3.5. Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trƣờng

70

3.5.1.Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược MEKOPHAR (MKP)........... 70
3.5.2. Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược phẩm TW 25 ....................... 75
3.5.3. Mẫu CEFACLOR 125 mg ........................................................................ 80
KẾT LUẬN 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO

86




mổ…Vì vậy việc phân tích kiểm nghiệm thuốc này trong sản xuất và phân phối là
hết sức cần thiết để đảm bảo chất lượng thuốc tốt và đủ hàm lượng.Hiện nay có rất
nhiều phương pháp phân tích loại thuốc trên như phương pháp đo quang, phương
pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phân tích điện hoá. Trong đó
phương pháp phân tích điện hoá là phương pháp có khả năng phân tích nhanh, thiết
bị hoá chất đơn giản, và đặc biệt là rẻ tiền hơn nhiều so với các phương pháp
khác.Chính vì những lí do đó mà trong luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu
xác định Cefaclor trong một số dược phẩm bằng phương pháp von - ampe hòa tan.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,15,33]
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm:
penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ
biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7- amino cephalosporinic
( 7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.
Cấu trúc và phân loại:
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam
S
R

CO




Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau.

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
R

Penicillin G

Hoạt tính
Gồm các Penicillin tự

(PENG)
nhiên

Nhóm penicillin tự

Tên kháng sinh

nhiên và dẫn chất. Phổ

CH 2 -

hẹp:

Benzathin
Benzyl

vi


N

Kháng

penicilliiase,không tác

O
Cl

I.

C-

Cloxacillin

động vào vòng
β – Lactam được.

CH3

6-{[3-(2-

(CLO)

chlorophenyl )-5-methyl-oxazole-

NH2 NH2

phổ rộng

(AMO)

6-{[(2R)-2-amino-2-

HO

(4-hydroxyphenyl)-acetyl]amino}
* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn
với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các
gốc R
R2
S
R1

CO

1

N
H

6

7
8

N

2


I: Phổ tác dụng trung

Cephalexin

bình, tác dụng mạnh nhất

(CEP)

H

-CH3

H

-CH=CH2

C HN H2

trên vi khuẩn gram (+),
yếu nhất trên gram (-).
Không bền và dễ bị βlactamase phá hủy
III: Tác dụng tốt trên vi Cefixim (CEF)

H2N

N

khuẩn gram (-), trên vi
S


AMO

2.8

CLO

2.7

AMP

2.7

CEP

2.6

CEF

2.75

OXA

2.72

Tác dụng:
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa

Tên
Dạng

Biệt
bào

dược
chế

:
:

Afeclor
Bột

pha

cap;
hỗn

Arlico
dịch

Cefaclor;
uống;

Viên

Bocefac
nang

tạo men penicillinase, coagulase dương tính, coagulase âm tính (khi được thử
nghiệm in vitro), có biểu hiện đề kháng chéo giữa cefaclor và methicillin, các vi
khuẩn hiếu khí, gram âm như Citrobacter diversus ,Escherichia coli ,Hemophilus
influenzae, bao gồm các chủng tạo men b-lactamase, kháng ampicillin... Các vi
khuẩn kị khí như Bacteroides spp (ngoại trừ Bacteroides fragilis), Peptococcus
niger.
1.2.2.4. Chỉ định
Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với thuốc:
- Nhiễm trùng đường hô hấp trên


- Nhiễm khuẩn tai mũi họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang, viêm amidale.
- Nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phế quản, cơn kịch phát của viêm phế
quản mãn.
- Nhiễm khuẩn da và mô mềm.
- Nhiễm trùng đường tiết niệu không biến chứng như viêm bàng quang, niệu đạo,
viêm thận - bể thận do lậu cầu.
1.2.2.5. Chống chỉ định
Không dùng thuốc cho bệnh nhân có tiền sử mẫn cảm với kháng sinh thuộc
nhóm cephalosporin.
1.2.2.6. Chú ý khi dùng
Tổng quát :
Cần thận trọng cân nhắc giữa nguy cơ và lợi ích khi chỉ định cho các bệnh
nhân có tiền sử rối loạn chảy máu, viêm loét đại tràng, viêm ruột khu trú hoặc viêm
đại tràng màng giả.
Phải ngưng dùng ở những bệnh nhân có phản ứng dị ứng với thuốc , và cần
được điều trị thích hợp với các thuốc tăng áp loại amine, kháng histamine hay
corticosteroide.
Dùng Cefaclor kéo dài có thể làm cho các vi khuẩn không nhạy cảm phát
triển quá mức.

dùng ở phụ nữ có thai nếu có chỉ định rõ ràng.
Lúc nuôi con có bú :
Cefaclor khuếch tán vào sữa mẹ, thường ở nồng độ thấp. Tuy nhiên các ảnh
hưởng trên người cho đến nay chưa được báo cáo. Cefaclor chỉ có thể dùng ở phụ
nữ nuôi con bú nếu có chỉ định rõ ràng.
1.2.2.7. Tƣơng tác thuốc
- Dùng đồng thời cefaclor và warfarin hiếm khi gây tăng thời gian prothrombin và
điều chỉnh liều nếu cần thiết.
- Probenecid làm tăng nồng độ cefaclor trong huyết thanh.


- Cefaclor dùng đồng thời với các thuốc kháng sinh aminoglycosid hoặc thuốc lợi
niệu furosemid làm tăng độc tính đối với thận.
1.2.2.8. Tác dụng phụ
Tỉ lệ xuất hiện các phản ứng quá mẫn là 1,5% với các đặc trưng gồm hồng
ban đa dạng, nổi ban hoặc các biểu hiện khác trên da đi kèm với viêm khớp/ đau
khớp, có sốt hoặc không sốt. Những phản ứng này thường thấy ở trẻ em hơn người
lớn. Các triệu chứng này thường xảy ra một vài ngày sau khi dùng thuốc và giảm
dần trong vài ngày sau khi dùng thuốc. Dùng thuốc kháng histamin và
glucocorticoid để điều trị các dấu hiệu và triệu chứng.
Hệ tiêu hoá: Tiêu chảy và viêm kết mạc màng giả.
Gan mật: Tăng men gan nhẹ, viêm gan.
Hệ thần kinh trung ương: Nhức đầu và chóng mặt, bồn chồn.
Mẫn cảm: Dị ứng nổi ban, ngứa, nổi mày đay.
1.2.2.9.Liều lƣợng
Cefaclor được sử dụng bằng đường uống.
- Người lớn: Liều thông thường là 250mg mỗi 8 giờ. Ðối với viêm phổi và viêm phế
quản, dùng 250mg, 3 lần mỗi ngày. Ðối với viêm xoang, dùng 250mg, 3 lần mỗi
ngày trong 10 ngày. Ðối với nhiễm khuẩn trầm trọng hơn (như viêm phổi) hoặc
nhiễm khuẩn do các vi khuẩn khác ít nhạy cảm hơn, có thể tăng liều gấp đôi. Liều

khác như dùng thuốc lợi tiểu mạnh, thẩm phân phúc mạc, lọc máu, thẩm tách máu
bằng than hoạt, chưa được xác định là có hiệu quả trong điều trị quá liều cefaclor.
1.2.2.11.Bảo quản
Bảo quản thuốc ở nhiệt độ phòng, 59 độ-86 độ F (15 độ-30 độ C).
Nên cất thuốc ở dạng dung dịch treo đã pha trong tủ lạnh. Vặn nắp chặt và lắc kỹ
trước khi dùng. Có thể cất giữ thuốc trong 14 ngày mà hiệu lực giảm không đáng
kể.
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam
1.3.1. Phƣơng pháp quang học


Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương
pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng
tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều
trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy
khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các
β-lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu
được 4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho
hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,
huyết thanh…
Theo [26], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống
bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra
phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và
giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách
pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các
loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính
xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau
khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã
mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối


với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể
phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Theo [40], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích
penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện
chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –
(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong
sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [27] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích βlactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C 18 (2.1
mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =
Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút
A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột
450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin
có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l
với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,
với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [24] C.Y.W Yang và cộng sự
dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò
(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346
nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do
các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng
quang hóa [24, 32] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ

điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp
0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ
lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [21] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh
họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8.


Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện
14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới
hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ
Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho
thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi
pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [30] sử dụng phương pháp CZE và detector UV
– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ
thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,
AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông,
nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l
cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.
Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bailón Pérez, L. Cuadros Rodríguez,
C. Cruces-Blanco [31] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO,
dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong
mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM
SDS pH = 8.5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD
0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương
đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7%. Độ thu hồi từ 91 – 95.6%.