TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


TRẦN THỊ LY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ
NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
ĐẤT Ở TỈNH VĨNH PHÚC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
Ths. Nguyễn Khắc Thanh

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths. Nguyễn Khắc Thanh
đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô trong tổ vi
sinh đã chỉ bảo và giúp đỡ, để em có thể hoàn thành được khóa luận
tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN, ban
giám hiệu nhà trường đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành
được khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng em cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

HSCC

: Hệ sợi cơ chất


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Các chủng xạ khuẩn sinh cellulase phân lập được từ đất

22

ở tỉnh Vĩnh Phúc.

3.2

Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh cellulase của
các chủng xạ khuẩn nghiên cứu.


Trang

3.1

Một số hình ảnh về xạ khuẩn

24

3.2

Hình ảnh khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của các chủng

26

xạ khuẩn nghiên cứu
3.3

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase

29

của chủng M10
3.4

Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn sinh trưởng

33

trong môi trường cacbon tự nhiên


MỤC LỤC
Phần mở đầu……………………………………………........................1
Chương 1. Tổng quan tài liệu……………………………………………...4
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn……………………………...…...…....4
1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn………………..….….5
1.1.2. Vai trò của xạ khuẩn……………………………………………...…..7
1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn……………………………………...8
1.2.1. Nhu cầu cacbon...……………………………………………………..9
1.2.2. Nhu cầu nitơ...………………………………………………………..9
1.2.3. Nhu cầu vitamin và khoáng…………………….............…………....10
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống của xạ khuẩn…………………….10
1.4. Cellulase và cellulose…………...……………………………………..12
1.4.1. Cellulose..……………………………………………………….…..13
1.4.1. Cellulase..……………………………………………………….…..14
1.5. Triển vọng, ứng dụng của cellulase……………………..…………….14
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu………………………..17
2.1. Vật liệu………………………………...………………………………17
2.1.1. Nguyên liệu…………………………..……………………………..17
2.1.2. Hóa chất…………………………………..…………………………17
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị……………………..…………………………...17
2.1.4. Môi trường phân lập xạ khuẩn……………………..……………….17


2.1.5. Môi trường thử hoạt tính cellulase của xạ khuẩn……………………19
2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………..……………………….20
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu………..………………..…………………….20
2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất…….....…..…………...20
2.2.3. Phương pháp bảo quản giống…………….………………………….21
2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn…..…..21
Chương 3. Kết quả và thảo luận…………………………………………22

Mặc dù xạ khuẩn không có khả năng sinh trưởng nhanh bằng nấm mốc
tuy nhiên hoạt tính cellulase của xạ khuẩn mạnh hơn rất nhiều, bên cạnh đó xạ
khuẩn có khả năng thích ứng tốt với môi trường đất, nước và ngay cả môi
trường không khí. Nếu nấm mốc cần điều kiện độ ẩm cao mới có thể phát
triển thì xạ khuẩn sinh trưởng ngay ở điều kiện độ ẩm thấp, nhưng mặc dù vậy
các nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trường độ ẩm thấp xạ khuẩn sinh
trưởng kém hơn rất nhiều so với môi trường lỏng, ở một số loài hoạt tính
enzyme còn kém đi.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngày càng nhiều
enzyme được ứng dụng trong đời sống như: proteinase ứng dụng trong công
nghiệp chế biến sữa, amylase trong công nghiệp rượu, cellulase ứng dụng

TrÇn ThÞ Ly

1

K32D – Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

trong sản xuất giấy, công nghiệp may, sợi, sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý
chất thải nông nghiệp, sản xuất các loại đường probiotin…
Như vậy cellulase và xạ khuẩn đều có vai trò quan trọng trong đời sống
con người. Đó cũng là lý do tôi chọn và nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập
được từ đất ở tỉnh Vĩnh Phúc” nhằm hiểu rõ hơn về khả năng sinh cellulase
của một số chủng xạ khuẩn, các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy ảnh

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ
+ Ảnh hưởng của pH
3. Ý nghĩa của đề tài
Đề tài góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự
nhiên của VSV nói chung và của xạ khuẩn nói riêng, tạo cơ sở khoa học cho
các phương thức canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân…) theo hướng lợi
dụng VSV phân giải cellulose, tăng cường các quá trình phân giải hợp chất
hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng.
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao ứng dụng
các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (ứng dụng trong chăn nuôi, bảo vệ môi
trường…).
Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy góp phần
vào tìm ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển. Từ đó tối ưu
hóa môi trường, ứng dụng sản xuất một lượng lớn cellulase trên quy mô
thương mại.

TrÇn ThÞ Ly

3

K32D – Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn
Krainki lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài


Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

tử, hóa sinh học, lí sinh học. Để phân loại nhanh chóng và chính xác người ta
sử dụng phân loại số, nghiên cứu các chủng loại phát sinh. Tuy nhiên hiện nay
trong thực nghiệm người ta vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, tính chất
nuôi cấy, đặc điểm sinh lí - sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử.
Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp vào 2
hệ thống sau đây:
+ Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái để phân loại
các nhóm lớn họ, giống. Các phân loại thấp hơn như loài thì dùng đặc điểm
nuôi cấy, sinh lí, sinh hóa để phân loại.
+ Hệ thống phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý như màu sắc hệ sợi để
phân nhóm, sau đó dùng đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài, nhóm hệ
thống này của Waksman, Gause Flaig... các tác giả đều thống nhất lấy đặc
điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài.
Phân loại xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Dựa vào đặc điểm hình thái người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính.
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo
hướng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng phân đốt
hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ V,T thường không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau,
người ta chia dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu chính.

TrÇn ThÞ Ly

nhất để phân loại xạ khuẩn. Người ta chia thành tế bào ra làm 4 dạng chính:
+ Type 1: Thành tế bào có L-ADP và Glixin.
+ Type 2: Thành tế bào có mDAP và Glixin.

TrÇn ThÞ Ly

6

K32D – Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

+ Type 3: Thành tế bào có mDAP.
+ Type 4: Thành tế bào có mDAP, đường arabinose, galactose.
Phân loại số
Dựa trên sựa đánh giá về mức độ giống nhau giữa các VSV trong một
số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa để so
sánh các chủng giống nhau từng đôi một theo công thức:
SAB = nS*100/ (nS+nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa 2 cá thể.
nS: Tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh.
nd: Tổng số các đặc điểm dương tính với chủng này mà âm tính với
chủng kia.
Kết quả của sự so sánh này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy
thuộc vào mức độ giống nhau mà các VSV được xếp vào các nhóm .
Nghiên cứu về phát sinh chủng loại

acid hữa cơ (acid lactat, acid axetat…)[6].
Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các chế phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều như: proteinase,
amylase, cellulase, kitinnase. Một số khác còn có khả năng tạo thành chất
kích thích sinh trưởng của thực vật.
1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của xạ khuẩn
Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa các VSV có quan hệ
mật thiết đối với các yếu tố của điều kiện sống. VSV cần ở tự nhiên hay môi
trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh dưỡng để xây dựng nên các hợp chất của
tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng[3].
Nhu cầu dinh dưỡng ở các loài VSV rất khác nhau. Ngay trong cùng
một loài VSV nhu cầu này cũng không có sự thống nhất. Giống như các loài
VSV khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. Trong
công nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh
dưỡng thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất. Ví dụ nuôi cấy thu
enzyme cellulase người ta quan tâm đến nguồn cacbon. Nhưng nếu mục đích

TrÇn ThÞ Ly

8

K32D – Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

sản xuất là làm thế nào để thu được một lượng lớn chất kháng sinh nào đó thì

K32D – Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

Ngun nit khú hp th hn c l nit khớ tri. Mt s loi VSV cú th
s dng ngun ny nh kh nng c inh nit (chuyn húa N--->NH3). Phn
ln cỏc loi x khun u cú i sng d dng nit. Ch mt s loi thuc
chi Frankraceae cú kh nng c nh nit nh cng sinh vi r cõy h u.
1.2.3. Nhu cu vitamine v cht khoỏng
Vitamine v cht khoỏng úng vai trũ khụng nh trong quỏ trỡnh sng
ca VSV. Trong t bo VSV ngoi nc, cỏc cht hu c cũn cú mt lng
ln cỏc vitamine v cht khoỏng. Lng cht ny trong t bo thay i theo
tựy loi. Tựy giai on, iu kin sinh trng mi yu t u cú tỏc ng nht
nh i vi s phỏt trin ca t bo VSV m cỏc nhõn t khỏc khụng th thay
th c.
Nguyờn t khoỏng c chia lm hai loi:
- Nguyờn t a lng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl
- Nguyờn t vi lng: Mn, Cu, Co, B
1.3. Cỏc yu t nh hng n hot tớnh cellulase ca x khun
Kh nng sinh tng hp cellulase ca cỏc loi VSV l rt khỏc nhau.
Mun cú c chng VSV cú kh nng tng hp mt vi loi enzyme no ú
cn phi phõn lp t t, nc, khụng khớ hay t mt s b phn ca ng thc vt hoc ly t mt b su tp ging vi sinh vt cú sn. Tuyn chn
chng VSV cú kh nng sinh trng, phỏt trin nhanh, sinh tng hp enzyme
cao, n nh
Cu trỳc ca mi protein enzyme c to thnh trong t bo u c
xỏc nh bi tớnh cht di truyn ca t bo, do ú cú th dựng tỏc nhõn t
bin tỏc ng lờn b mỏy di truyn ca VSV nhm to ra cỏc dng t bin cú

nhiờn phng phỏp ny ch ỏp dng c vi nhng VSV cú kh nng sinh
trng v phỏt trin mnh, thớch nghi vi mụi trng rn thng c ng
dng cho cỏc ging nm mc, hu nh khụng ỏp dng i vi x khun.
+ Phng phỏp nuụi chỡm [7]
phng phỏp ny ngi ta cho VSV sinh trng trong mụi trng
dinh dng lng cú sc khớ liờn tc. phng phỏp nuụi chỡm s tit enzyme
vo mụi trng din ra trong sut quỏ trỡnh sinh trng. a s cỏc enzyme
thy phõn ca nm mc, x khun, vi khun l nhng enzyme ngoi bo do
ú sau khi kt thỳc quỏ trỡnh lờn men cú th lc b sinh khi thu ly dch
enzyme em cụ c c ch phm thụ hoc tinh sch tip theo. Tuy nhiờn

Trần Thị Ly

11

K32D Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

i vi enzyme ngoi bo mun thu sinh khi cn phi phỏ v t bo tỏch
enzyme ra khi phn sinh khi t bo.
Phng phỏp ny tit kim din tớch sn xut, d c gii húa v t ng
húa, nng sut cao, s dng hp lý cỏc ngun dinh dng cú trong mụi trng
nuụi cy, enzyme thu c ớt nhim tp cht. Tuy nhiờn tn in nng, nng
enzyme trong canh trng thp phi cụ c nờn giỏ thnh cao. Mụi trng
ny rt thớch hp vi cỏc ging x khun.
Nhu vy thnh phn dinh dng trong mụi trng nuụi cy nh hng

Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học và
có cường lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme đều tác động
nên một cơ chất nhất định. Một điều đang lưu ý là tất cả các enzyme có nguồn
gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp
thực phẩm và y học.
1.4.1. Cellulose
Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi dào trong tự nhiên, chiếm tới 4050 % hydratcacbon. Cellulose và hemicellulose là thành phần chủ yếu tạo lên
bộ khung xương tế bào thực vật. Hàng năm có hàng tỉ tấn cellulose được thải
ra môi trường thông qua rác thải mà chủ yếu là xác thực vật…
- Đặc điểm cấu tạo
Cellulose là một polysaccharide mạch thẳng gồm từ 1400 đến 12000
gốc ß-D-Glucose liên kết với nhau bởi các liên kết ß-1,4-Glucozide. Trong
phân tử cellulose các phân tử ß-D-Glucose có cấu trúc không gian dạng ghế
bành. Hai phân tử khác nhau quay góc với nhau 1800.
Cellulose có cấu tạo dạng sợi song song dài khoảng 5µm với đường
kính khoảng 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các
liên kết Vandervan, tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10 - 40nm gọi là
vi sợi. Các vi sợi này có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của
cellulose. Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng:
+ Vùng kết tinh: vùng này có cấu trúc chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản sự
hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu trúc
cellulose.
+ Vùng vô định hình: có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị trương lên, dễ bị
phân giải.

TrÇn ThÞ Ly

13

K32D – Sinh

Trong vi thp k tr li õy cựng vi s phỏt trin mnh m ca cụng
ngh sinh hc, cỏc ch phm enzyme c sn xut ngy cng nhiu v c
s dng hu ht trong cỏc lnh vc kinh t. Enzyme ó tng bc lm thay i
v nõng cao mt s quỏ trỡnh cụng ngh trong ch bin thc phm, nụng
nghip, chn nuụi, y t

Trần Thị Ly

14

K32D Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

Các protease là các enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay, ứng
dụng trong chế biến thực phẩm (ví dụ: đông tụ sữa, làm phomat, làm mềm
thịt), sản xuất các chất tẩy rửa, thuộc da. Tiếp đến là các hydratcacbonase
trong số đó cellulase là một trong những enzyme đáng lưu ý, được ứng dụng
trong kỹ nghệ chế biến thực phẩm, công nghệ dệt nhuộm, công nghiệp giấy,
chế biến thức ăn gia súc như, xử lý môi trường…
Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng với
nhiều mục đích và tác động ở nhiều mức độ khác nhau. Người ta có thể sử
dụng tác động của enzyme để điều chỉnh những khiếm khuyết tự nhiên của
nguyên liệu. Enzyme có thể tham gia cải thiện hoặc tiêu chuẩn hóa các quá
trình chuyển hóa, cho phép nhận các sản phẩm mới hay sản phẩm có chất
lượng cao hơn. Đặc biệt enzyme có thể can thiệp vào chính qua trình chế biến
và đóng vai trò công cụ công nghệ. Nhờ tác dụng của enzyme chúng ta có thể

TrÇn ThÞ Ly

16

K32D – Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
CHƢƠNG 2

PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất lấy từ các loại đất thuộc phường Xuân Hòa – Phúc Yên –
Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NH4Cl, KNO3, KNO2,
NaNO3, (NH4 )2SO4, NaCl, FeSO4…..
Tinh bột tan, saccharose, thạch agar, CMC (Cacboxyl Methyl
Cenlulose), bột giấy…
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ: hộp petri, ống nghiệm, bàn trang, que cấy, đèn cồn, bình
tam giác, giá đựng ống nghiệm.
- Thiết bị: tủ ấm vi sinh (Heraeus – Đức), tủ sấy (Heraeus – Đức), nồi
hấp (Tomy – Nhật Bản), cân Sartorius, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh.
2.1.4. Môi trƣờng phân lập xạ khuẩn
- Môi trường 1: Gause I, pH = 7,0


FeSO4

Vết

Thạch agar

20g
17

K32D – Sinh