TRƯỜNG ĐẠI HỌC s u PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ THƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC
CHỮA BỆNH TIỂU ĐƯỜNG
METFORMIN HYDROCHLORIDE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
•

•

•

•

C h u y ên n g à n h : H ó a h ữ u cơ

Người hướng dẫn khoa học
GS.TS Nguyễn Văn Tuyến

HÀ NỘI - 2015


L Ờ I CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Hóa Dược - Viện
Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trong suốt quá trình nghiên cún và hoàn thành khóa luận, ngoài sự nỗ
lực của bản thân, em còn nhận được sự giúp đõ' của Ban giám hiệu nhà

1.1.3. Quan niệm của y học cô truyấĩ về bệnh tiêu đuừĩg.................................................. 5
1.1.4. Các thuốc Đông y điều trị bậih tiấi đường............................................................... 5
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride................................5
1.2.1. Tông quan về Metformin hydrochloride....................................................................5
1.2.2. Tĩnh hình nghiên cứu trong nước............................................................................. 7
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước..............................................................................8
1.2.4. Cácphươngpháp nghiên cứu.................................................................................10
1.3. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ........17
1.3.1. Điắn nóng chảy (Mp).............................................................................................17
1.3.2. Độ quay cực ([a]D)................................................................................................ 18
1.3.3. Phô cộng hưởng ứ ’hạt nhân.................................................................................. 18
1.3.4. Phô khối lượng (Mass spectrocopy, MS)................................................................ 20
CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................21
2.1. Mục tiêu của khóa lu ậ n ...................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết b ị.......................................21
2.3. Định tính phản úng và kiếm tra độ tình khiết của các họp chất bằng sắc kí lóp mỏng.. 24
2.4. Định lượng phản úng.............................................................................................. 25
2.5. Phương pháp thực nghiệm....................................................................... 25
2.6. Tống họp Metformin hydrochloride..............................................................26
2.7. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride..........................................................26
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cap (LD50) của metformine hydrochloride...........27
2.9. Nghiên cún hàm lượng metformine hydrochloride ửieo phương pháp HPLC-MS)...27
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u VÀ THẢO LU Ậ N ..............................28


3.1. Tổng họp metformine hydrochloride..............................................................28
3.2. Nghiên cún kết tình metformine hydrochloride.......................................................... 31
3.3. Nghiến cứu xác định độc tính cap (LD50) của metformine hydrochloride...................32
3.4. Hàm lượng metformin hydrochloride theo phương pháp HPLC.................................34
KẾT LU Ậ N ................................................................................................................. 37

Phô hông ngoại
(Infrared Spectroscopy)

MS

Phô khôi lượng va chạm điện tử
( Electron Impact-Mass Spectrometry)

Rf

Hệ sô di chuyên

ÔH, 5C

Độ chuyên dịch hóa học của proton và cacbon

Ppm

Phân triệu
( parts per million )

s

Singlet

CHCỈ3

Clorofom

EtOH

Sơ đồ 1.2: Quá

trình tống hợp 1-cyanoguanidine.................................................. 7

Sơ đồ 1.3: Quá

trình tổng hợp metformin hydrochloride.....................................8

Sơ đồ 1.4: Quá

trình tống hợp metformin hydrochloride theoShapiro............... 9

Sơ đồ 1.5: Quá

trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi..........9

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về m etform in..............................................9
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của m etform in............................................... 10


MỜ ĐÀU
Tiểu đường là căn bệnh nguy hiếm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm
trọng sức khoẻ con người và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu
đường tuýp II (chiếm tới 90-95%). Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đường, tử
vong của bệnh này đứng hàng thứ tư ở các nước phát triển, bệnh có thể gây
nhiều tai biến nguy hiêm như: mù loà và giảm thị lực ở người trưởng thành;
đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn người bình thường từ 15-40 lần; suy thận
giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những
biến chứng tim mạch nguy hiêm. Theo ước tính, hiện thế giới có 194 triệu
người mắc bệnh tiểu đường chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ước tính đến năm

Tiểu đường tuýp I:
Tiểu đường tuýp I là một bệnh tự miễn trong đó hệ thống miễn dịch
của cơ thế phản ứng lại và phá huỷ tế bào p sản xuất insulin của đảo tuỵ.
Sự thiếu hụt insulin

dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các

biến chứng mãn tính.
Khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường thuộc loại I,
phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuối (
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các
sulfonylurea đã được tiến hành. Các nghiên cún ngày càng làm sáng tỏ cơ
chế tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao
gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh.
1.1.2.2. Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
R- N H -

c- N H - c - N H2
II

II

NH

NH

Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang được sử dụng phồ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đường huyết, không gây hạ đường huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
không có tác dụng kích thích tế bào p tuyến tuỵ bài tiết insulin.

4


acetone và dichloromethane;
- Điểm nóng chảy: 225°c - 226°c.
1.2.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Metformin là một thuốc chống tiểu đường nhóm biguanid, có cơ chế
tác dụng khác với các thuôc tiêu đường nhóm sulfunylure, metformin không
kích thích giải phóng insulin từ các tế bào tuyến tụy. Metformin không có tác
dụng hạ đường huyết ở người bình thường, metformin làm giảm sự tăng
đường huyết nhưng không gây tai biến hạ đường huyết. Metformin làm giảm
nồng độ glucose trong huyết tương cả khi đói và sau bữa ăn của người bệnh
tiểu đường tuýp II.
Cơ chế tác dụng ngoại biên của metformin là:
- Làm tăng sử dụng glucose ở tế bào.
- Cải thiện liên kết của insulin với thụ thể.
- ứ c chế tống hợp glucose ở gan và làm giảm hấp thu glucose ở một.
- Ngoài ra, metformin phần nào còn ảnh hưởng tốt trên chuyển hóa
lipoprotein, thường bị rối loạn ở người bị đái tháo đường không phụ thuộc
insulin.
1.2.1.4. Dược động học
- Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đường tiêu
hóa, sinh khả dụng tuyệt đối của 500mg metformin uống lúc đói là 50 - 60%.
Thức ăn làm giảm mức độ và tốc độ hấp thu của metformin.
- Phân bo: Metformin liên kết với protein huyết tương với mức độ
không đáng kể, thuốc phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch, cả vào trong
hồng cầu.
- Chuyển hóa: Metformin không bị chuyển hóa ở gan.

6


-

3CaCN2 + 3C0 2

60 0 -7 5 0 ° c

Calci cyanamide

So' đồ 1.1: Quá trình tổng họp calci cyanamid
Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản
ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai
đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300°C
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn họp trên ở nhiệt độ

750°c

*Bưó’c 2: Tống họp 1-cyanoguanidine :
Từ calci cyanamide đã được tổng hợp trong bước 1, đem đun nóng trong
dung môi H 2 0 nhận được 1-cyanoguanidin được mô tả trong sơ đồ sau:
CaCN2

+

H20

^ ^
30 phút

H2N -C -N H -C N
NH


h2n - c - n h - c n
II
NH

+

(CH3)2NH.HCI

t°c

NH
LĨ 'CH3
h2n - c - n h - c n
II
ch3
NH
,

•HCI

metformin hydrochloride
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride
Mặc dù phương pháp tông hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền
như: CaO, ure và dimethylamin nhưng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ
cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy
mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide).
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tĩnh hạ đường huyết
và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được
FDA cho phép lun hành đê chữa bệnh tiêu đường tuýp 2 ở Mỹ [5J.

Sơ đồ 1.7: Tổng họp các dẫn xuất của metformin
Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự
đã nghiên cún tống hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức
này đã được nghiên cún hoạt tính hạ đường huyết. Ket quả nghiên cứu cho
thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [11].
Ket quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất
của metformin với platin cho thấy phức chat tetrachloro (metformin) platin
(IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư P388 tương
tự như Cis-platin [4].
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, họp chất
metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 rất hiệu quả
mà cũng có khả năng chống ung thư tuyến tụy, ung thư vú [3,6,7,9,10,14,15].
Từ các tư liệu đã có có thể thấy rằng con đường tổng hợp metformin từ
dicyano diamide là khả thi. Tống họp theo con đường này chỉ có một bước
phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực
hiện được ở quy mô pilot.
1.2.4. Các phương pháp nghiên cứu
Ỉ.2 .4 .Ỉ. Phương pháp sắc kỉ bản mỏng
Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm.
Thông thường sản phấm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang
khác nhau... Dùng sắc kí lóp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy
ra, kết thúc phản ứng.

10


Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp
phụ, thường là Silicagel 60F254, aluminum oxide được phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong
dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí

1.2.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyến một
chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không
hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). Như vậy
ta có quá trình chiết lỏng.
Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích
tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp
chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác.
Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản
chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gì thêm. Chọn được dung
môi (dung môi chiết CH2C12) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người
ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi hỗn hợp bất kì. Trường hợp chất
chiết có màu ta có thế sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng
theo các phương pháp đo quang.
1.2.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được
chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.2.4.4. Sắc kí cột
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất
thử đối với chất hấp phụ đế tách các chất riêng ra. Nhưng trong sắc kí cột,
chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là
sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục,
hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.

12


Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột
có thế là những ống hình trụ dài 3 0 - 1 OOcm, đường kính từ 1 - 8cm tùy theo
chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.

vết kém phân cực nhất lên R f khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là
dung môi đẩy vết phân cực nhất lên R f khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí
với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ỷ:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
- Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù họp đã chọn được ở trên
nhung cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ
như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt
chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
- Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH.
Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách vói kích thưóc cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng
silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 - 50 lần khối lượng của mẫu
chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì
tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 - 200 lần).
Tỉ lệ giữa chiều cao lượng Silicagel và đưòng kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì
chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ
khoảng 10:1.
Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho
silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
Cách nạp silicagel vào cột

14


Đe việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách
đồng nhất đế hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột
theo hai cách.

- Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm
sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho
vào cột.
Nạp silicagen ở dạng khô
- Cột được giữ thắng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột
(nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào
khoảng hai phần ba cột.
- Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa
gõ nhẹ thành cột. Khi lóp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ
khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót
trở lại đầu cột).
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn
định trước khi nạp mẫu vào.
- Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
Cách nạp mâu vào cột
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và
phương pháp ướt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mầu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường họp mẫu chất
không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị
mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lượng
silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ đế có
thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi
đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột
mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ

16


thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để

tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử.
Neu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá

0,5°c

thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh

17


khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.3.2. Độ quay cực ([a]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đắng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phắng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phắng chứa tia sáng và vuông góc
với mặt phang dao động gọi là mặt phang phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thắng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phang phân cực sẽ bị quay một góc a. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thế sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn củakk góc quay a
phụ thuộc vào nồng độ

c

(g/lOOml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung