BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TOLUENE

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS.NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ NGỌC THẢO NGUYÊN
MSSV:3082615
LỚP:CNSHTT K34

Cần Thơ, Tháng 05/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Võ Ngọc Thảo Nguyên



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƢỢC
Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp cuộc sống con người ngày càng tốt
hơn. Tuy nhiên, công nghiệp hóa không đi liền với bảo vệ mội trường dẫn tới những
ảnh hưởng tiêu cực lên Trái Đất cũng như sức khỏe con người. Nhiễm độc Toluene,
một loại dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến ở ngành công nghiệp sơn và thuộc
da, là vấn đề đang được các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm. Mục tiêu của đề tài
là phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy
Toluene. Mẫu đất thu được tại 04 nguồn: mẫu dất gần Nhà máy thuộc da Tây Đô, Xí
nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa có nguy cơ nhiễm độc Toluene cao ở
địa bàn thành phố Cần Thơ được tăng sinh khối vi khuẩn bằng cách ủ với Toluene ở
nồng độ 1% và 10% ở 45oC ở cả hai pha khí và pha lỏng và sử dụng môi trường MSB
(mineral salt basal) để phân lập. Các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển với
Toluene là nguồn carbon duy nhất và khả năng tạo enzyme protease, cellulase,
amylase và lipase được giải trình tự và chứng minh khả năng phân hủy bằng phương
pháp đếm mật số phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất ở các nồng độ 0%,
1%, 1,5%, 2%. Từ 04 nguồn đất đã phân lập được 09 dòng vi khuẩn. Hầu hết các
dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp các enzyme. Ba dòng được tuyển chọn chính
là T14, T38 và T50. Kết quả giải trình tự và so sánh bằng BLAST cho biết các dòng vi
khuẩn này có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14),
Bacillus subtilis (T38) và Acinetobacter sp. (T50). Dòng T38 (Bacillus subtlis) được
chọn để kiểm tra khả năng sử dụng Toluene như nguồn carbon duy nhất và đã chứng
minh có thể phát triển ở nổng độ Toluene 1% và 1,5%.
Từ khóa: Dung môi hữu cơ, nhiễm độc Toluene, phân lập, sự phân hủy, vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2.4.2. Phân hủy kỵ khí ............................................................................................... 11

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

2.5. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................12
2.5.1. Ngoài nước....................................................................................................... 12
2.5.2. Trong nước....................................................................................................... 13
CHƢƠNG 3. .................................................................................................................14
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................14
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................14
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 14
3.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 15
3.1.3. Vật liệu ............................................................................................................. 16
3.1.4. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................ 16
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................16
3.2.1. Chuẩn bị thí nghiệm......................................................................................... 16
3.2.2. Phân lập vi khuẩn............................................................................................. 17
3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ......................................... 17
3.2.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene ...................... 19
3.2.5. Khảo sát khả năng tạo một số enzyme ............................................................ 19
3.2.6. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ....................................... 20

PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ lục 1: Kết quả
1. Kết quả trả cứu BLAST của dòng T14 ......................................................................
2. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T38 ......................................................................
3. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T50 ......................................................................
Phụ lục 2: Kết quả ...........................................................................................................
1. Bảng 13: Kết quả thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy
Toluene (OD 600nm) .....................................................................................................
2. Bảng 14: Kết quả thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme của các dòng vi khuẩn .............

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Phụ lục 3: Kết quả thống kê ...........................................................................................
1. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme protease.......................................................
2. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme lipase..........................................................
3. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme cellulase ......................................................
4. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme amylase .......................................................

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với
quá trình tăng trưởng...........................................................................................10
Hình 2: Nguyên tắc pha loãng.……………………………………………..…..22
Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn sau 2 ngày……………..……25
Hình 4: Kết quả nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn.............................................26
Hình 5: Chỉ số đo OD của các dòng vi khuẩn ở ngày 0, ngày 02 và ngày
04..................................................................................................................27
Hình 6: Vòng sáng được tạo ra trong môi trường CMC và tinh bột của một số dòng vi
khuẩn.............................................................................................................................31

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHỮ VIẾT TẮT
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
CDC: Centers for Disease Control and Prevention

Các phương pháp xử lý truyền thống đối với những vùng bị nhiễm độc dung môi
hữu cơ hay hydrocarbon bao gồm tách lớp đất đã bị ô nhiễm, cách ly vùng bị ô nhiễm
(Vidali, 2001). Tuy nhiên, những phương pháp này không hiệu quả vì không giải
quyết được triệt để nguồn ô nhiễm. Ngoài ra, phương pháp đốt hoặc dùng hóa chất
cũng được sử dụng nhưng lại có nhiều nhược điểm và đòi hỏi kinh phí cao. Trong tình
hình đó, phương pháp xử lý sinh học xuất hiện như một giải pháp tích cực giúp xử lý ô
nhiễm hydrocarbon với những ưu điểm như giá thành thấp, không đòi hỏi kỹ thuật cao
và tận dụng được quá trình phân hủy tự nhiên của vi sinh vật. Cũng chính vì lẽ đó mà
các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để có thể tìm ra những loài vi
khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hiệu
quả của biện pháp xử lý sinh học.
Việt Nam với những quần thể vi sinh vật phong phú sẽ là địa điểm đầy tiềm năng
để có thể phân lập được những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene với hiệu
quả cao. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy
Toluene” được đề xuất.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy
Toluene.


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thƣờng gặp
Nhóm

Tên dung môi hữu cơ

Hợp chất có chứa clo

Trichloroethane
Trichloroethylene
Methylene chloride
Chloroform
Carbon tetrachloride

Hợp chất aliphatic

Hợp chất vòng thơm

Rượu/Glycol/ Ether

Carbon disulphide
Pyridine
amide
amine

(*Nguồn: http://www.uq.edu.au/ohs/pdfs/organicsolvents.pdf., ngày 10/01/2013)

Dung môi sử dụng trong công nghiệp thường là hỗn hợp của nhiều chất khác
nhau. Ví dụ như dung môi “methylated spirit” là sự pha trộn giữa methanol và ethanol.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Có thể có tới 20 hợp chất trong một số dung môi hữu cơ. Ví dụ: White Spirit,
Turpentine and Kerosene (Tyson et al., 1992).
2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ
Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), ở
Mỹ, 9,8 triệu công nhân phơi nhiễm với dung môi hữu cơ có trong các sản phẩm như
sơn, véc-ni, chất kết dính, keo dán, chất tẩy nhờn và trong ngành sản xuất thuốc
nhuộm, polymer, plastic, vải, mực in, sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm. Điều đáng
lo ngại là rất nhiều những dung môi hữu cơ được cảnh báo bởi NIOSH (Viện quốc gia
về an toàn lao động và sức khỏe) như chất gây ung thư (benzene, carbon tetrachloride,

Trường ĐHCT

benzen tích lũy này có thể gây các biểu hiện bệnh lý: Gây ra sự tăng tạm thời của bạch
cầu; gây ra sự rối loạn oxy hoá - khử của tế bào dẫn đến tình trạng xuất huyết bên
trong cơ thể; nếu hấp thu nhiều benzen cơ thể sẽ bị nhiễm độc với các hội chứng khó
chịu, đau đầu, chóng mặt, nôn, có thể dẫn đến tử vong vì suy hô hấp. Nếu thường
xuyên tiếp xúc với benzen có thể gây nhiễm độc mãn tính. Lúc đầu là rối loạn tiêu
hoá, ăn kém ngon, xung huyết niêm mạc miệng, rối loạn thần kinh, đau đầu, bị chuột
rút, cảm giác kiến bò, thiếu máu nhẹ, xuất huyết trong, phụ nữ hay bị rong kinh, khó
thở do thiếu máu. Tiếp theo là xuất huyết trong nặng, thiếu máu nặng, giảm bạch cầu.
Phụ nữ bị nhiễm độc nặng có thể bị đẻ non hoặc sẩy thai đây là bệnh nguy hiểm vì
benzen có thể tích luỹ lâu dài trong tuỷ xương. Bệnh có thể xuất hiện sau 2 năm kể từ
khi bị nhiễm benzene (Bạch Thái Toàn, 2008).
Benzen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các chất hữu cơ, dùng
làm dung môi hoà tan mỡ, cao su, vecni, tẩy da, vải sợi, lau khô, tẩy dầu mỡ bám trên
các dụng cụ, vật liệu, phương tiện. Năm 1997, Chính phủ nước ta đã có quyết định
cấm dùng benzen làm dung môi pha chế sơn. Những ngành khác cần sử dụng benzen
thì phải được sự cho phép của cơ quan có thẩm quyền. Điều này cho thấy benzen cực
kỳ độc hại. Người sử dụng hãy cảnh giác với các sản phẩm sơn, nhất là sơn được sản
xuất bằng công nghệ lạc hậu. Chất thải từ các nhà máy thuộc da, dệt nhuộm cơ khí, các
xưởng sửa chữa tân trang xe, máy, đóng tàu cũng là những nguồn phát thải benzene
(Bạch Thái Toàn, 2008)
Nhiễm độc Toluen: Toluen là chất dễ bay hơi, cháy nổ. Chỉ cần một nồng độ nhỏ
1/1000, Toluen đã gây cảm giác mất thăng bằng, đau đầu, nếu nồng độ cao hơn có thể
gây ảo giác, choáng ngất. Toluen có trong sơn, nhựa, keo dán công nghiệp và là chất
xúc tác trong công nghệ in ảnh (Bạch Thái Toàn,2008)
Sự hấp thu dung môi hữu cơ thường qua tiếp xúc ngoài da hoặc qua đường hô
hấp. Nhân tố ảnh hưởng tới tốc độ và mức độ hấp thụ qua da bao gồm thời gian tiếp
xúc, nồng độ dung môi và tình trạng của da (độ ẩm của da, vết thương…) và tính tan
của các dung môi. Tốc độ thâm nhập qua da đã được chứng minh liên quan trực tiếp

2.3.1. Biện pháp xử lý sinh học là gì?
Biện pháp xử lý sinh học (bioremediation) được định nghĩa là quá trình mà
những chất thải hữu cơ được phân hủy bằng con đường sinh học dưới điều kiện được
kiểm soát cho đến khi đạt được trạng thái vô hại hoặc đến mức độ được chấp nhận bởi
cơ quan quản lý (Vidali, 2001). Quần thể vi khuẩn sử dụng trong xử lý sinh học có thể
là quần thể có sẵn tại điểm ô nhiễm hoặc những quần thể được đưa vào từ nơi nguồn
khác.
Bởi vì biện pháp xử lý sinh học có những ưu điểm vượt trội so với các phương
pháp truyền thống khác như giá thành rẻ hơn, thân thiện với môi trường nên được sự
quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Năm 1975, Dick Raymond đã nhận bằng sáng
chế cho biện pháp xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm nhiễm gas. Phương
pháp này bao gồm sự kích thích sự phát triển vi khuẩn tại chỗ bằng cách bổ sung chất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

dinh dưỡng. Rõ ràng qua hơn 50 năm, xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm
đã cho thấy những thành công và hiểu biết hơn về xử lý ô nhiễm, đặc biệt đối với ô
nhiễm dầu mỏ (petroleum). Trong những năm gần đây, ứng dụng của biện pháp xử lý
sinh học được phát triển ở lĩnh vực xử lý dung môi, hydrocarbon thơm đa vòng, dioxin
và kim loại (Hazen, 2010). Thật vậy, biện pháp sinh học đã được áp dụng trên nhiều
địa điểm trên khắp thế giới bao gồm Châu Âu với mức độ thành công khác nhau


Trichloroethylene
Perchloroethylene

Hiếu khí

Kỵ khí

Nguồn

+

Chất tẩy rửa khô
Sản xuất hóa chất

4-Chlorobiphenyl
4,4Dichlorobiphenyl

+

Sản xuất điện
Trạm xăng dầu
Đường ray tàu lửa

Chlorinated phenol

Pentachlorophenol

+


Propham
2,4-D

+

Polychlorinated biphenyls

Thuốc trừ sâu

+

+

Sản xuất và tồn trữ dầu
Nhà máy nước ngọt
Đất
Trạm xăng dầu
+

Nông nghiệp
Nhà máy xử lý gỗ
Sản xuất thuốc trừ sâu
Đất

(*Nguồn: Vidali, 2001)
(Ghi chú: *: (+) nằm trong nhóm vi khuẩn)

Đối với quần thể vi sinh vật cho quá trình xử lý sinh học, ta có thể chia thành 4
nhóm bao gồm quần thể hiếu khí, kỵ khí, nấm ligninolytic và methylotrohps (Vidali,
2001).

Hiếu khí, tối thiểu diện tích các lỗ khí
đạt 10%
N và p cho sự phát triển của vi sinh vật
15-45

Chất ô nhiễm

Không quá độc hại

Hydrocarbon chiếm 5-10%
trọng lượng khô của đất
700 ppm

Chỉ số
Độ ẩm đất
pH của đất
Oxy

Kim loại nặng

Tổng cộng 2000 ppm

C:N:P= 100:10:1
20-30

(*Nguồn: Vidali, 2001)

2.4. Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ
Bởi vì bản chất của các dung môi hữu cơ chính là những hợp chất hữu cơ nên ta
có thể dựa vào cơ chế chung của phân hủy hợp chất hữu cơ (hydrocarbon) để biết được

2.4.2. Phân hủy kỵ khí
Mặc dù, phân hủy hiếu khí được xem như là con đường chủ yếu trong phân hủy
hydrocarbon. Khả năng phân hủy hydrocarbon theo con đường kỵ khí của vi khuẩn
cũng là một mảng nghiên cứu đầy hứa hẹn vì ngày càng nhiều hợp chất hydrocarbon
được chứng minh là có thể được phân hủy bởi những vi sinh vật hiếu khí (Heider,
1999). Thay vì, sử dụng enzyme oxygenases như trong quá trình phân hủy hiếu khí,
các vi khuẩn phân hủy hiếu khí sử dụng một số phản ứng enzyme khác để thay thế.
Quy trình hoạt hóa liên kết C-H bao gồm: thủy phân với nước bằng enzyme có chứa
cofactor là molybdenum, thêm fumarate bằng enzyme có tâm là glycyl, sử dụng
methyl-coenzyme M reductase để đảo ngược quá trình methanogenesis, methyl hóa,
carboxyl hóa (Boll, 2010). Con đường sinh hóa của quá trình phân hủy alkylbenzenes,
toluenes và ethylbenzene đã được làm rõ (Heider, 1999).
Quá trình phân hủy của Toluene bắt đầu bởi phản ứng cộng của toluene methyl
vào nối đôi của fumarate để tạo thành benzylsuccinate nhờ vào enzyme có tâm là
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

glycyl. Sau đó, quá trình tổng hợp của benzylsuccinate thành benzoyl-CoA và
succinyl-CoA được thực hiện nhờ vào sự oxy hóa.
2.5. Tình hình nghiên cứu
2.5.1. Ngoài nƣớc
Vào năm 1989, nhiều dòng của chủng vi khuẩn Pseudomonas putida đã được

Trường ĐHCT

2.5.2. Trong nƣớc
Các nghiên cứu về phân hủy dung môi hữu cơ của nước ta hiện nay vẫn chưa
nhiều. Chỉ có một số nghiên cứu về khả năng kháng dung môi hữu cơ của vi khuẩn, ví
dụ như khả năng kháng benzene (Vũ Thành Công, 2010). Những đặc tính và hiệu quả
của quá trình phân hủy dung môi hữu cơ cần được nghiên cứu sâu hơn.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3.
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dung cụ thí nghiệm
- Đĩa Petri
- Ống nghiệm
- Bình tam giác 100, 250, 500 ml
- Chai lọ thủy tinh
- Đầu col xanh, vàng, trắng
- Các loại ống tuýp 1,5ml; 2,5 ml