1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN
(NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM
VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.)
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Vinh - 2015


2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN
(NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM
VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.)
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ


học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Trần Đình
Thắng - Trường Đại học Vinh và GS. TS. Tian-Shung Wu - Đại học Quốc gia ChengKung, Đài Nam, Đài Loan là người những thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều
kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án. PGS. TS Ping-Chung
Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi,
động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn PGS. TS PingChung Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện
luận án.
PGS. TS. Ngô Anh - Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế đã giúp định danh
các mẫu nấm.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, khoa Hoá học, cán
bộ phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng ban chức năng của Trường Đại học Vinh, các
thầy cô, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã
động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Vinh, ngày 20 tháng 10 năm 2015

Nguyễn Thị Ngần


iii

MỤC LỤC
Trang
Mở đầu

1

1. Lý do chọn đề tài

1


5

1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn

6

1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm

6

1.1.2.2. Khả năng kháng virut

13

1.1.2.3. Gây độc tế bào, chống ung thư và tăng cường hệ thống miễn dịch

16

1.1.2.4. Những hoạt tính khác

22

1.2. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

25

1.2.1. Đặc điểm và sự phân bố

25


30


iv
được
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

30

2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học

31

2.2. Hóa chất và thiết bị

31

2.2.1. Hoá chất

31

2.2.2. Thiết bị

31

2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

31


33

2.2.2.10. Độ quay cực riêng

33

2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes

33

melanoporus)
2.3.1. Mẫu nấm

33

2.3.2. Phân lập các hợp chất

33

2.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 hợp chất NDM1, NDM2

36

2.3.4. Hằng số vật lý các hợp chất

37

2.3.4.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới)

37


2.3.4.9. Hợp chất NDM-9

42

2.3.4.10. Hợp chất NDM-10

43

2.3.4.11. Hợp chất NDM-11

43

2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)

44

2.4.1. Mẫu nấm

44

2.4.2. Phân lập các chất

44

2.4.3. Thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ quả thể nâm vân chi

47

2.4.3.1. Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất DQE-1


2.4.4.6. Hợp chất DQE-6

53

2.4.4.7. Hợp chất DQE-7

53

2.4.4.8. Hợp chất DQE-8

54

Chương 3: Kết qủa và thảo luận

55

3.1. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

55

3.1.1. Mẫu nấm

55

3.1.2. Phân lập các hợp chất

55

3.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất


76

3.1.3.8. Hợp chất NDM-8

78

3.1.3.9. Hợp chất NDM-9

80

3.1.3.10. Hợp chất NDM-10

83

3.1.3.11. Hợp chất NDM-11

83

3.1.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B

85

3.2. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)

86

3.2.1. Mẫu nấm

86


103

3.2.3.7. Hợp chất DQE-7

108

3.2.3.8. Hợp chất DQE-8

10

3.2.4. Hoạt tính sinh học của hợp chất tramecubin A (DQE-1)

111

Kết luận

116

Danh mục công trình công bố

118

Tài liệu tham khảo

119

Phụ lục

133


Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của chất NDM-6

75

Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-7

77

Bảng 3.9: Số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-8

79

Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-9

81

Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-11

84

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nigrofomin A và

85

nigrofomin B
Bảng 3.13: Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi

87



112


viii

DANH SÁCH HÌNH

Trang
Hình 1.1. Ảnh nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

26

Hình 1.2. Ảnh nấm vân chi (Trametes cubensis)

27

Hình 3.1: Phổ ESI-MS của hợp chất NDM-1

56

Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-1

57

Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-1

57

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất NDM-1


Hình 3.12: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-2

65

Hình 3.13: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất NDM-2

66

Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của chất NDM-2

66

Hình 3.15: Phổ HMBC của NDM-2

67

Hình 3.16: Phổ NOESY của NDM-2

68

Hình 3.17: Sự tương tác xa (H↔H) trong phổ NOESY của NDM-2

69

Hình 3.18: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất NDM-5

73

Hình 3.19: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất madolin A


92

Hình 3.27: Phổ NOESY của chất DQE-1

92

Hình 3.28: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC, H→H trong phổ COSY

93

của chất DQE-1
Hình 3.29: Phổ khối lượng ESI-MS của DQE-2

95

Hình 3.30: Phổ khối lượng HR-ESI-MS của DQE-2

95

Hình 3.31: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2

96

Hình 3.32: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2

97

Hình 3.33: Phố 1H-NMR của hợp chất DQE-2



Trang
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 và -9

35

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11

36

Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết quả thể nấm Trametes cubensis

45

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -2, -6, -7, -8

46

Sơ đồ 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -3, -4, -5

47


xi

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

CC: Column Chromatography (Sắc kí cột)
FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)
TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

xii
TMS: Tetramethylsilan
DMSO: DiMethylSulfoxide
Đ.n.c.: Điểm nóng chảy.
EC50: Giá trị 50% các tế bào hoặc gốc tự do bị chết hoặc được tạo ra bởi DPPH được
trung hòa.


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một
trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới
với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương sống đã được mô
tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao,
khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400
loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài,
nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng
sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận. Nấm dược liệu ở Việt Nam
có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dược liệu quý như Linh chi
(Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)…[6, 31, 32].
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn
tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dược liệu (polysaccarit, polysaccaritprotein..) dùng để điều trị bệnh [47]. Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có
chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dược liệu [81], chúng hầu hết là các glucan
với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung
thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con người [14, 16]. Ngoài
những hợp chất có khối lượng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lượng nhỏ
như triterpenoit, flavonoit,…được phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã được ghi nhận
có khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm
[126].

được thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chiết hỗn hợp các chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)
và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis);
- Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai
loại nấm trên;
- Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập được;
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.


3
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc
xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu
được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các
phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột
nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế trên các pha đảo, pha silica gel.
- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất được
phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV),
phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù
electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR,
13

C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC.
- Cấu hình tương đối của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp

phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phương pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray).


01 hợp chất axit benzoic;

Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này.
* Xác định được các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất nigrofomin A. Các số
liệu về tinh thể học của hợp chất này hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge.
* Hai hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B đều có khả năng gây độc các dòng
tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thư biểu bì vòm họng ở người (NPCTW01), ung thư phổi (NCI-H661).
* Từ dịch chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập được 8 hợp
chất:
-

04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-

hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Tramecubin A và tramecubin B là các hợp chất
mới;
-

02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit;

-

02 hợp chất coumarin: oospolacton và oospoglycol;

Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này.
* Hợp chất mới tramecubin A và tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả năng
gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô liên kết (RD);
hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+)
(ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC
7754, SH 20) với các kết quả âm tính.

phòng chống bệnh tật như các loài nấm sau: Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis),
phục linh, vân chi, linh chi, nấm hương… Những loài nấm này được sử dụng rộng rãi,
với nhiều bài thuốc dân gian khác nhau nhằm điều trị nhiều loại bệnh. Trong những
phương thuốc này, hai loài nấm C.sinesis, Ganoderma lucidum được xếp vào loại thuốc
quan trọng [7, 31, 35, 90].
Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy rằng lớp nấm nang, nấm sinh sản vô tính
và nấm đảm là những loài nấm có khả năng sản sinh ra các sản phẩm chuyển hóa bậc hai
có hoạt tính sinh học, quen thuộc nhất là từ các loài nấm thuộc các chi Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Phoma, Alternaria, Acremonium, và Stachybotrys,
Ganoderma, Lactarius và Aureobasidium [111].


6
Số lượng các nghiên cứu được đầu tư công nghệ phân lập, phân loại nấm ngày
càng nhiều, ngày càng hiện đại. Do đó, từ những năm 1990 đến nay, nhiều mẫu nấm lớn
trên thế giới đã được tìm thấy, đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng và nấm biển được chú ý
như nguồn nguyên liệu mới, đa dạng có hiệu quả tốt nhằm cung cấp cho ngành dược liệu.
Nấm lớn dược liệu có số lượng rất lớn, có sự đa dạng sinh học phong phú [15, 72].
1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn
Trong lịch sử nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm lớn, hợp chất chuyển
hoá bậc hai được phân lập đầu tiên là từ nấm lớn là axit mycophenolic từ P.glaucoma
được công bố bởi Gosio. Đến năm 1929, nhà bác học Alexander Fleming công bố hợp
chất penicillin được phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum, có khả năng kháng khuẩn
hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Đây là sự phát hiện
vĩ đại, cho thấy con đường mới, quan trọng mở ra con đường mới cho việc tìm ra các loại
thuốc trong y học hiện đại.
Năm 1940, các chất chuyển hoá bậc hai từ nấm lớn mới thật sự được sự chú ý đặc
biệt [125]. Từ đó đến nay, các nhà khoa học phân lập được khoảng hơn 8.600 hợp chất
chuyển hoá bậc hai có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loài nấm lớn [111].
1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm

O

(3) Oospolacton

Nhóm hợp chất khác có khả năng kháng nấm nữa đó là những hợp chất polyketit
chẳng hạn như axit merulinic A, B và C (4-6) được phân lập từ quả thể nấm Merulius
tremellosus và Phlebia radiata [28].

(4) Axit merulinic A (R1=OH, R2=H)
(5) Axit merulinic B (R1=H, R2=OH)
(6) Axit merulinic C (R1=H, R2=H)

Hợp chất axit mirulinic thể hiện khả năng kháng nấm với giá trị MIC trong khoảng
0,4-10 µg/mL, chống lại các chủng nấm Arthrobacter citreus, B. subtilis,
Corynobacterium insidiosum, Micrococcus roseus và Sarcina lutea. Hợp chất 5 và 6 thể
hiện khả năng kháng chủng nấm Micrococcus phlei, trong khi hợp chất 4 không có khả
năng này. Ngoài ra, hợp chất 5 còn có khả năng kháng các chủng nấm S. aureus và
Proteus vulgaris.


8
Nấm Merulius tremellosus không sản sinh hợp chất 5 nhưng tạo ra hợp chất
secquiterpenoit merulidial (7), có khả năng kháng nấm cao hơn hợp chất 5 [28]. Hoạt tính
sinh học của hợp chất 7 do trong phân tử sự có mặt của hai nhóm andehit [78].
OH
H

OHC
CHO



O
H
R

(12) Pleurotellol (R=CH2OH)
(13) Axit pleurotellic (R=COOH)


9
Ngoài khả năng kháng khuẩn, kháng nấm thì hợp chất 9 và 12 còn có khả năng
kìm hãm sự phát triển của thực vật [59].
Hai hợp chất hirsutan khác có tên axit hirsutic (14) và axit complicatic (15) được
phân lập từ Stereum compliatum [64], hợp chất (15) thể hiện khả năng kháng khuẩn dòng
S. aureus [60].
H

O

O

COOH

H

(14) Axit hirsutic

(15) Axit complicatic

Khả năng kháng nấm của hợp chất secquiterpen β-D-xylosit có tên là aleurodiscal


O

O

O

H

O

HO

O

HO

(19) 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3β-ol

(20) Lanostanoit

Một số hợp chất triterpen với kiểu khung lanostan có tên axit polyporenic C (21),
axit 3α-axetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic (22), axit pinicolic A (23), axit trametenolic B
(24) và axit fomitopsic (25) được phân lập từ Fomitopsis pinicola, những hợp chất này có
khả năng kháng khuẩn dòng B. subtilis nhưng chỉ thể hiện khi thử trên TLC với nồng
khối lượng từ 0,01-1 µg nhưng lại không thể hiện khả năng này khi thử trên bản agar với
nồng độ lên tới 50 µg/mL [42].
HOOC

OH


(25) Axit fomitopsic

R2
R1

O

O

H3COOC

OCH3

O
O

(26) Strobilurin A (R1=H, R2=H)

H3COOC

OCH3

(27) Strobilurin E

(28) Strobilurin F1 (R1=OH, R2=H)
(29) 9-methoxystrobilurin A (R1=H, R2=OCH3)
OCH3

H3COOC