BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------------
------------------
PHẠM THỊ HỒNG THÁI
ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG VÀ
CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC CON LAI
SOMA KHOAI TÂY SAU DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------------
------------------
PHẠM THỊ HỒNG THÁI
ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG VÀ
CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC CON LAI
SOMA KHOAI TÂY SAU DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01
Hoàng Thị Giang là những người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên
tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa sau ñại học, các cán bộ trong
phòng Công nghệ sinh học khoai tây-Viện sinh học nông nghiệp ñã giúp ñỡ
và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài tại
Viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn ñến các bạn ñồng nghiệp, và người
thân trong gia ñình ñã ñộng viên giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi trong suốt
thời gian học tập và hoàn thành tốt luận văn này./.
Hà Nội ngày 15 tháng 9 năm 2013
Học viên
Phạm Thị Hồng Thái
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan
ii
Lời cảm ơn
iii
Mục lục
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1
Thông tin chung về cây khoai tây
4
1.1.1
Nguồn gốc
4
1.1.2
Phân loại
4
1.1.3
Tầm quan trọng của cây khoai tây
6
1.2
Bệnh mốc sương trên khoai tây
16
1.3.3
Triệu chứng
19
1.3.4
Giải pháp khắc phục
19
1.4
Tính kháng bệnh mốc sương trên cây khoai tây
24
1.4.1
ðặc ñiểm xâm nhiễm của nấm Phytopthora infestans
24
1.4.2
33
2.1.2
Vật liệu nghiên cứu
34
2.1.3
ðịa ñiểm
34
2.1.4
Thời gian
35
2.2
Nội dung nghiên cứu
35
2.3
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các lát cắt củ -“Tuber slice test”
39
2.3.6
Phương pháp ñánh giá sự có mặt của các gen kháng bệnh mốc
sương của các vật liệu bằng maker phân tử
2.3.7
40
Các chỉ tiêu ñánh giá ñặc tính nông sinh học của con lai soma và
các dòng/giống khoai tây bố mẹ
43
2.3.8
Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa sinh
43
2.4
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
44
3.2.2
48
Kết quả ñánh giá khả năng kháng/ nhiễm bệnh mốc sương của
các các con lai soma và các dòng/ giống khoai tây bố mẹ bằng
phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (tuber slice test)
3.3
52
Kết quả ñánh giá sự có mặt của gen kháng mốc sương RPi bằng
chỉ thị phân tử
55
3.3.1
Kết quả chiết tách và ñiện di kiểm tra ADN tổng số.
56
3.3.2
Kết quả chạy PCR với các cặp mồi kháng bệnh mốc sương
57
3.4
Phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh ñánh giá chất lượng củ của các
ñối tượng thí nghiệm.
70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
73
1
Kết luận
73
2
ðề nghị
74
TÀI LIỆU THAM KHẢO
75
PHỤ LỤC
78
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
NSLT
Năng suất lý thuyết
5
NSTT
Năng suất thực thu
6
M
Ladder
7
ADN
Acid Deoxyribonucleic
8
bp
Base pair
9
1.1
Tên bảng
Trang
Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế
giới năm 2011
1.2
8
Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam giai
ñoạn 2006 – 2010
9
2.1
Các giống/dòng khoai tây trồng, dại ñược chọn là cây bố mẹ
2.2
Các dòng con lai soma giữa các dòng khoai tây dại và các giống
34
khoai tây trồng trong chọn tạo giống
2.3
soma và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ.
3.4
46
Kết quả ñánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá ñơn tách rời.
3.3
33
57
Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, khả năng cho
chọn lọc, ra hoa của các con lai soma và các dòng/giống khoai
tây bố mẹ.
3.7
61
Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất củ của các
dòng/giống khoai tây bố mẹ và các con lai soma
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
65
Thành phần dinh dưỡng của củ khoai tây luộc và nướng
1.2
Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật
21
2.1
Mô lá nhiễm bệnh và các dạng bào tử
37
3.1
Lát củ mang triệu chứng bệnh mốc sương sau khi ñược lây
nhiễm 7 ngày
3.2
46
Triệu chứng Phytophthora infestans xuất hiện trên các lá ñơn
tách rời của sau 5 ngày lây nhiễm
3.4
45
con lai
3.8
63
Màu sắc hoa của 2 giống có khả năng ra hoa cao của con lai
2195/2 của tổ hợp Delikat + pnt 2G; 2292/4 của tổ hợp lai
Delikat+ blb2G
64
3.9
Hình ảnh số củ thu ñược trên 1 khóm của một số tổ hợp con lai soma
67
3.10
Hình ảnh về ñặc ñiểm hình thái củ của 1 số tổ hợp lai
69
3.11
Hình ảnh về ñặc ñiểm hình thái củ của 1 số tổ hợp lai có con lai
soma bị biến dị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
bệnh mốc sương ñã mở ra những triển vọng mới mẻ và khả thi cho công cuộc
chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ñang có nhiều khó khăn. Các
nhà khoa học ñã có trong tay nguồn vật liệu kháng bệnh mốc sương hết sức
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1
quý giá. Thế nhưng, do các dòng khoai tây dại là các thể nhị bội (2n = 2x) còn
các giống khoai tây trồng lại là thể tứ bội (2n =4x) và ở các chi, loài khác
nhau nên việc lai tạo hữu tính nhằm chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương
từ khoai tây dại sang khoai tây trồng là bất khả thi. Trong bối cảnh này việc
lựa chọn kỹ thuật dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng là
cách tiếp cân sáng suốt, mới mẻ và khả thi. Con ñường dung hợp protoplast là
con ñường có hiệu quả nhất ñể khắc phục ñược khó khăn trong quá trình lai
tạo hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra sự tái
tổ hợp gen ở những loài xa nhau ñể tạo ñược con lai soma mang những ñặc
tính của cả dòng bố và mẹ ñược dung hợp.
Theo cách tiếp cận trên, trong khuôn khổ ñề tài hợp tác với Viện JKI
Cộng hòa Liên bang ðức,Viện Sinh học Nông nghiệp Trường ðại học nông
nghiệp Hà nội ñã tiến hành dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại
với các giống khoai tây trồng nhằm tạo ra các dòng khoai tây vừa phù hợp với
yêu cầu chế biến vừa có khả năng kháng bệnh mốc sương làm vật liệu khởi
ñầu cho việc phát triển tạo giống khoai tây chế biến kháng bệnh mốc sương.
Các nghiên cứu về dung hợp tế bào trần của Viện Sinh học nông nghiệp ñã
ñạt ñược các kết quả có ý nghĩa, tạo ñược hàng loạt các dòng con lai soma.
Công việc bắt buộc phải tiến hành tiếp theo là việc ñánh giá khả năng chuyển
ñặc tính kháng bệnh từ các dòng khoai tây dại cho khoai tây trồng cũng như
các ñặc tính nông sinh học của các con lai soma thu ñược. Trên cơ sở này sẽ
chậu vại.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thông tin chung về cây khoai tây
1.1.1. Nguồn gốc
Khoai tây là loại cây trồng cổ ñại. Theo các bằng chứng về khảo cổ
học, lịch sử và thực vật học cho biết trung tâm khởi nguyên cây khoai tây
thuộc vùng Nam Mỹ, gần hồ Titicaca giữa ranh giới Peru và Bolivia. Ngày
nay, nhiều loại khoai tây dại còn tồn tại ở ñây, ñặc biệt ở dãy Andes (Salama
1937, 1939, 1949).
Vào khoảng những năm 1500 cây khoai tây bắt ñầu “cuộc hành trình
tới các châu lục”, từ dãy Andes ñi tới các nước Châu Âu, Châu Á....
Khoai Tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật học người Thụy sỹ
C.Bauhin và J.Bauhin mang tới, ñược trồng rộng rãi vào năm 1773. Từ Châu
Âu khoai tây sang tới Ấn ðộ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm
1A16 vào Nhật Bản. Khoai tây ñến với Áo, Italia, ðức và các vùng lãnh thổ
Châu Âu vào cuối thế kỷ XVII. Khoai tây ñược trồng trên quy mô lớn vào
những năm 1800 và tới khoảng thế kỷ XIX mới thực sự phổ biến trên các
châu lục.
Ở Việt Nam, khoai tây ñược người Pháp ñưa vào trồng năm 1890 ở
một số vùng: Tú Sơn – Hải Phòng, Trà Lĩnh – Cao Bằng (1907), Thường Tín
– Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005). Hiện nay, khoai tây ñược trồng tập trung chủ
yếu ở ðồng Bằng Sông Hồng, Sapa, ðà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ,
ôn hòa… (ðỗ Kim Chung, 2003).
1.1.2. Phân loại
S. chaucha Juz. Et Buk. là dạng lai tự nhiên giữa S. tuberosum
subp.Vaifgena và S. stenotomum.
S. juzepczukii Buk. Là dạng lai tự nhiên giữ S. acuale và S.
snenotomum, phân bố ở trung Peru ñến Nam Bolivia, có khả năng kháng bệnh
sương mai.
• Nhóm 3: Tetraploid: 2n = 4x = 48.
Có 1 loài là: S. tuberosum L. Và 2 loài phụ là :
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5
Subspecies tuberosum
Subspecies Vaifgena (juz. Et Buk) Hawkes
• Nhóm 4: Pentaploid: 2n = 5x = 60.
Có 1 loài là : S. curtilobum juz et Buk.
1.1.3. Tầm quan trọng của cây khoai tây
Khoai tây ñược ví như kho báu ngoài yếu tố thuộc nhóm thực phẩm cao
cấp, ngoài thành phần dinh dưỡng trong củ phong phú và ña dạng bao gồm:
tinh bột, protein, lipit, các loại vitamin (B1, B2, B3, B6, PP, C), các chất
khoáng, các axitamin tự do. Thì nó cũng có nhiều tính chất ñáng quý khác
như: dễ trồng, dễ mọc, không ñắt, chất lượng cao,… phong phú về giá trị sử
dụng: chế biến ñược nhiều món ăn, làm thuốc chữa bệnh (bệnh viêm loét dạ
dày, hành tá tràng, bệnh thần kinh, bỏng, quai bị.
Khoai tây là cây dễ thích nghi, năng suất cao, thích ứng với chi phí ñầu
vào thấp. Mọi bộ phận trên củ khoai tây ñều có giá trị dinh dưỡng, thành phần
dinh dưỡng trong 100 gam củ khoai tây sau khi luộc cả vỏ và nướng:
Hình 1.1. Thành phần dinh dưỡng của củ khoai tây luộc và nướng
Theo nguồn: United States Department of Agriculture, National
7
Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế
giới năm 2011 (FAOSTAT)
Nước
Diện tích
Sản lượng
Năng suất
(ha)
(tấn)
(tấn/ha)
Trung Quốc
5.077.504
74.799.084
14,7
Ấn ðộ
ðức
255.200
10.201.900
40,0
Ba Lan
490.853
8.765.960
17,9
Bangladesh
435.000
7.930.000
18,2
Belarus
366.766
7.831.110
khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều
hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong
thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO, 2005).
Do ñó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong
tương lai, với diện tích trồng ngày càng ñược mở rộng. Ở các nước ñang phát
triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém một phần là do nguồn giống
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
8
không ñảm bảo chất lượng, củ giống không rõ nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh
nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn ñến sự thoái hóa củ giống nghiêm
trọng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ. Do vậy, các nhà nghiên cứu
ñang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạch bệnh và có phẩm chất tốt
phục vụ sản xuất khoai tây thương mại.
1.2.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam
Ở Việt Nam, khoai tây do người Pháp ñưa vào năm 1890, sau ñó ñược
trồng rộng rãi và tập trung chủ yếu ở lưu vực ðồng Bằng Sông Hồng. Trong
những năm gần ñây, sản xuất khoai tây ở nước ta ñã có những bước tiến
triển ñáng kể về diện tích cũng như năng suất, chất lượng củ.
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam
giai ñoạn 2006 - 2010 (FAOSTAT)
Chỉ tiêu
Diện tích
(hecta)
Sản lượng
37.000
388.000
10,49
2010
37.100
446.200
12,03
Năm
Bảng số liệu cho thấy diện tích khoai tây ñược trồng ở Việt Nam trong
giai ñoạn 2006 – 2010 ñang ngày một tăng, tính ñến năm 2010 diện tích
trồng khoai tây của nước ta ñạt 37.100 ha. Cùng với việc mở rộng diện tích
trồng, năng suất cây khoai tây không ngừng tăng lên qua các năm, trong ñó
giai ñoạn có sự tăng lên rõ rệt về năng suất là từ năm 2009 – 2010, năng suất
khoai tây tăng từ 388.000 lên 446.200 (ñạt 58.200 tấn). Trong 3 yếu tố trên,
sản lượng khoai tây trồng là yếu tố khá biến ñộng, năm 2010 lần ñầu tiên sản
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9
1.3. Những nghiên cứu về nấm mốc sương Phytopthora infestans (Mont.)
de Bary (P.I.) và bệnh mốc sương trên cây khoai tây.
Bệnh hại trên khoai tây rất ña dạng về thành phần và nguyên nhân gây
bệnh. Trong sản xuất, khoai tây bị rất nhiều dịch hại tấn công như: nấm, vi
khuẩn, virus, tuyến trùng… Thành phần bệnh trên cũng khá ña dạng: bệnh
mốc sương, bệnh héo rũ gốc mốc trắng, bệnh héo vàng, bệnh ñốm lá, bệnh
héo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus, bệnh sưng rễ do tuyến trùng nốt
sưng… Trong ñó bệnh mốc sương do nấm Phytopthora infestans gây ra là
bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất, ñặc biệt nếu bùng phát thành dịch sẽ rất
nguy hiểm ở các vùng chuyên canh.
1.3.1. Giới thiệu về nấm Phytopthora infestans
Bệnh mốc sương khoai tây, cà chua do nấm Phytopthora infestans gây
ra là một trong những bệnh ñược nghiên cứu nhiều nhất, với lịch sử nghiên
cứu dài nhất, tuy vậy cho ñến nay bệnh vẫn là một trong những bệnh hại nguy
hiểm nhất trong lịch sử nhân loại.
Có nhiều tác giả nghiên cứu về trung tâm phát sinh của nấm
Phytopthora infestans nhưng vẫn chưa có kết luận chính xác về trung tâm
phát sinh của loài nấm này. Theo những nghiên cứu của những nhà khoa học
ñầu tiên nghiên cứu về bệnh này là Berkelay và De Bary thì trung tâm phát
sinh của bệnh là dãy Andes Nam Mỹ, ñây cũng là trung tâm phát sinh của
khoai tây – kí chủ chính của nấm mốc sương. Reddick (1939) cho rằng nấm
mốc sương có trung tâm phát sinh ở cao nguyên miền trung Mexico. Các
nghiên cứu gần ñây về trung tâm phát sinh của bệnh này cho rằng Mexico là
trung tâm ña dạng sinh học của loài nấm Phytopthora infestans nhưng vẫn
chưa kết luận rằng Mexico hay dãy Andes là trung tâm phát sinh của loài nấm
này (Abad, 1998). Mizubuti và Fry (2006) cũng kết luận rằng Mexico là trung
tâm ña dạng sinh học của nấm mốc sương. Mexico cũng là nơi ñầu tiên phát
hiện ra chủng nấm A2. Chủng quần ở hầu hết các nước trên thế giới là vô tính,
ở Châu Âu và Châu Mỹ một thời gian ngắn sau bệnh mốc sương cũng nhanh
chóng lan truyền và gây hại nặng ở các vùng trồng trọt này. Bệnh mốc sương
ñã gây ra mất mùa khoai tây ở vụ ñông năm 1845 và năm 1846 tại Ireland làm
hơn 1,5 triệu người chết ñói và gần 1 triệu người chết trong khi di cư sang Mỹ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12
ñể tránh nạn ñói này. Bệnh mốc sương cũng gây nạn ñói thứ 2 xảy ra ở nước
ðức năm 1919 (Leontine Colon, Bent J. Nielsen and Ulrich Darsow, 2004).
Nấm Phytopthora infestans thuộc họ Pythiacease lớp nấm trứng
(Oomycetes), bộ nấm sương mai (Peronosporales) lớp nấm này thuộc một
giới (Kingdom) khác hẳn với nấm thật (true fungi), thực vật, ñộng vật và
procaryote. Một số tác giả cho rằng lớp nấm trứng thuộc về giới Protoctista
một số khác thì cho rằng nó thuộc giới Chromista.
Nấm gây hại trên khoai tây, cà chua tạo ra các triệu chứng ña dạng tùy
thuộc vào giống và ñiều kiện thời tiết. Trên lá bệnh lúc ñầu chỉ là những ñiểm
nhỏ màu xanh tái hình dạng không ñều sau biến thành màu nâu và xanh nhạt,
vết bệnh không có giới hạn rõ rệt (Stevenson, 1993). Lúc ñầu bệnh thường
xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau ñó lan rộng vào phiến lá tạo những ñám mô
bị thối nâu, khi trời ẩm ướt mặt dưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nấm
trắng xốp như sương muối (Drenth, Janssen và Govers, 1995) ñó là ñám cành
bào tử phân sinh và bào tử phân sinh của nấm gây bệnh. Còn ở trên thân, bị
bệnh từng ñoạn dài, vỏ và ruột phần thân thối ướt màu nâu ñen. Chỗ bị bệnh
nhỏ tóp lại có khi chỉ một phía thân bị thối. Khi ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp
nấm trắng như sương muối bao phủ, khi thời tiết khô vết bệnh tóp lại. Cành
thân bị bệnh dễ bị gãy gục.
Trên củ khoai tây bị bệnh, vết bệnh thường bị nhầm lẫn với một số
hoặc có dạng hữu tính, lúc này sẽ sinh ra bào tử trứng. Bào tử trứng ñược hình
thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi
nấm là bao trứng (Oogonium), và bao ñực (Antheridium). Sau khi giao phối,
nhân của bao ñực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng
bội (Oospore) với kích thước khoảng 31 x 50 µm. Khi ở vùng khí hậu không
thuận lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nấm thì
nấm mốc sương chỉ sinh sản theo kiểu vô tính.
Khả năng tồn tại của bào tử vô tính cũng ñã ñược nhiều tác giả nghiên
cứu. Bào tử và sợi nấm gần như không có khả năng qua ñông. Bào tử có thể
tồn tại từ vài ngày tới vài tuần trong ñất ẩm (Adrivon, 1995) nhưng không có
khả năng tồn tại trong thời gian rất dài ñặc biệt là không có khả năng sống sót
trong ñất khô (Fernandez, 2004). Tuy vậy khi bào tử hoặc sợi nấm nếu ñã tấn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
14
Copyright: Tài liệu đại học ©