BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI
KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA
Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa, năm 2014


i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI
KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA
Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản
Mã số: 60 62 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. VÕ VĂN NHA
2. TS. LÊ MINH HOÀNG

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi của các bạn
ñồng nghiệp thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản và dự báo, Trung tâm quốc gia
quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền
Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III ñể tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ñến Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau ðại học,
Trường ðại học Nha Trang, cùng quý thầy cô ñã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời
gian qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn ñến gia ñình ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Tác giả


iv
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa …………………………………………………………………

i

LỜI CAM ðOAN ……………………………………………………………...

ii

LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………….........

iii

MỤC LỤC ……………………………………………………………...............

iv


1.1.2 Tại Việt Nam ……………………………………………………………...

6

1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của
vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish)
Hoa Kỳ…………..………………………………………….........
1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuẩn E. ictaluri ……...

6
6

1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E.
ictaluri ……………………………………………………………............

8

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.
ictaluri …………………………………………………………………………….

11

1.3 Khả năng phát triển của chủng E. ictaluri bị ñột biến gen và chủng E.
ictaluri chưa bị ñột biến gen (chủng “hoang dại”) trên một số môi trường

12

nuôi cấy khác nhau ………………………………………………
1.4 Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E. ictaluri hiện nay trên Thế

2.2 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………….

16

2.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ………………………………………...

18

2.2.1 Thời gian nghiên cứu ……………………………………………………..

18

2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu ……………………………………………………..

18

2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn .…………………...

18

2.5. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………

19

2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của
vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……………………………...

19


gen purA với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid ....

25

3.2 Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột
biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản …………………………

26

3.2.1 Kết quả tìm hiểu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ………………………………
3.2.2 Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị

26


vi
ñột biến gen purA theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau ………

32

3.2.3 Kết quả nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ……………….

33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………………

43


OD: Optical Density (mật ñộ quang)
ODC: Ornithine decarboxylase
O/F: Oxydation/Fermentation
ONPG: β- Galactosidase
TSA: Tryptone Soya Agar – Môi trường không chọn lọc TSA


viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả vòng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen
purA và vi khuẩn E. ictaluri chưa bị ñột biến với kháng sinh thuộc
nhóm aminoglycosid …………………….…………………....................

25

Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E.
ictaluri bị ñột biến gen purA và chủng chưa ñột biến gen purA………

27

Bảng 3.3 ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen
purA, E. ictaluri chưa ñột biến gen purA ……………………………..

29

Bảng 3.4 Kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA (E.
ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa ñột biến gen purA (E. ictaluri WT)

32


khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA trên môi trường nuôi cấy BHIB có
bổ sung kanamycine và không bổ sung kanamycine ...............................
Hình 3.2

24

Kháng sinh ñồ của vi khuẩn E. ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến
gen purA (A) và vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (B) ................... 26

Hình 3.3

Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (A, B) ........................ 28

Hình 3.4

Vi khuẩn E. ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến gen purA (A) và vi
khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA (B) ..................................................

Hình 3.5

28

Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA trên môi
trường DMM có bổ sung adenine và không bổ sung adenine OD – mật
ñộ quang ..................................................................................................

Hình 3.6

31




x
khoáng ở 4oC theo thời gian...................................................................... 37
Hình 3.11 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
và E. ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC ..

39

Hình 3.12 Kết quả khảo sát sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
và E. ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC ..

39

Hình 3.13 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA bảo
quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian ........................................

40

Hình 3.14 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri ñột biến gen purA
bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian .................................

41


1

MỞ ðẦU
Trên thế giới, các nghiên cứu ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
là tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfish) ở Mỹ, cá trê trắng (Clarias

2
nhược ñộc làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ
thuật ñột biến gen. Tuy nhiên, cho ñến nay việc lưu giữ, bảo quản chủng E. ictaluri bị
ñột biến gen purA chưa có tài liệu nào ñề cập ñến, có chăng chỉ nhằm phục vụ trực
tiếp cho những nghiên cứu về khả năng sử dụng chúng làm vaccine phòng bệnh gan
thận mủ cho cá tra.
Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, ñược sự ñồng ý của
Trường ðại học Nha Trang, Viện trưởng Viện Nuôi trồng Thủy sản, thầy giáo hướng
dẫn, tôi thực hiện ñề tài “Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau”
Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài luận văn:
+ Xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bị ñột biến gen purA trong môi trường có chứa kháng sinh ñồng thời xác ñịnh ñược
khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở
các ñiều kiện bảo quản khác nhau. Từ ñó có ñược ñiều kiện bảo quản phù hợp.
Nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn:
+ Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị
ñột biến gen purA.
+ Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột
biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài luận văn:
- Về khoa học: Kết quả của luận ñề tài luận văn ñã xác ñịnh ñược khả năng phát triển
của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA trong các ñiều kiện bảo
quản từ ñó làm tiền ñề cho những nghiên cứu tiếp theo về việc lưu giữ chủng vi khuẩn
này.
- Về thực tiễn: ðề tài luận văn góp phần nâng cao hiểu biết cho chính học viên về lĩnh
vực vi sinh vật ñột biến gen. ðồng thời cũng chỉ ra ñược ñiều kiện lưu giữ chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA, làm cơ sở ban ñầu ñể lưu giữ
nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá
tra.

thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate
sẽ không xảy ra, dẫn ñến ATP không ñược hình thành ñể cung cấp năng lượng cho quá
trình chuyển hóa từ XMP thành GMP), tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA
và RNA (Hình 1.1). Từ ñó làm ảnh hưởng trược tiếp ñến khả năng sinh trưởng vi
khuẩn E. ictaluri, gây ảnh hưởng gián tiếp ñến ñộc lực của chủng vi khuẩn này [1].


4

Hình 1.1 Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA
Chủng vi khuẩn khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA (LSU-E2) không gây
chết cho cá nheo Mỹ khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn
hay ngâm nhưng gây chết khoảng 50% khi sử dụng phương pháp tiêm với liều khoảng
107 – 108 cfu/cá. ðiều này có thể do các gen qui ñịnh ñộc tính của chủng LSU-E2 vẫn
nguyên vẹn [34].
Thune và cộng sự (1997) [48] tạo thành công chủng E. Ictaluri khuyết dưỡng
adenine bằng phương pháp ñột biến gen purA dựa trên nguyên tắc của hiện tượng tái
tổ hợp tương ñồng của các trình tự AND. Chủng E. Ictaluri bị ñột biến gen purA
(LSU-E2) tạo ra ñược ñem thử nghiệm ñộc lực cho thấy, cá thí nghiệm tiêm chủng
LSU-E2 ở nồng ñộ 105 và 106 cfu/cá cho tỉ lệ cá chết tích lũy là 0%, trong khi ñó với
nồng ñộ tiêm tương tự ñối với chủng E. ictaluri hoang dại tỉ lệ tương ứng là 96,7% và
100% . Với phương pháp tiêm, chủng ñột biến có liều gây chết LD50 là 5,1 x 107 cfu/cá
so với chủng hoang dại (
6
sinh kháng thể và kích hoạt miễn dịch trung gian tế bào, vi khuẩn bị làm yếu ñộc lực
không có khả năng hoàn ñộc do không tái tạo lại ñoạn gen gây bệnh hay gen khuyết
dưỡng ñã bị loại bỏ.
1.1.2. Tại Việt Nam
Nhiều nghiên cứu trong nước tạo vi khuẩn E. ictaluri bất hoạt bằng nhiều phương
pháp khác nhau ñể dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine. Nguyễn Hữu Thịnh và
cộng sự (2009) thử nghiệm vaccine bất hoạt vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp
ngâm kết hợp cho ăn 2 lần, kết quả cho tỷ lệ bảo hộ ñạt 52% [47].
Tuy nhiên, kể từ khi sử dụng vaccine phòng bệnh cho vật nuôi thủy sản năm
1987 [38], ñến nay vẫn có ít những sản phẩm vaccine sống ñược tạo ra ñáp ứng nhu
cầu của thị trường. Việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo các vi sinh vật ñột biến
dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine trong lĩnh vực thủy sản Việt Nam hiện nay chỉ
có ở giai ñoạn bắt ñầu. Trong ñề án phát triển và ứng dụng công nghệ xinh học trong
lĩnh vực thủy sản của chính phủ Việt Nam, năm 2010 ñã triển khai thực hiện ñề tài cấp
Nhà nước “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược ñộc dung làm
vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật
gây ñột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì. Nhóm nghiên
cứu phối hợp với Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh ñã tạo thành
công 03 chủng vi khuẩn: E. ictaluri bị ñột biến gen purA, E. ictaluri bị ñột biến gen
aroA và E. ictaluri bị ñột biến gen ch [11]. Các chủng vi khuẩn ñột biến này ñã ñược
xác ñịnh là ổn ñịnh về mặt kiểu gen và kiểu hình so với chủng vi khuẩn gốc ban ñầu
[11], [12].
Như vậy, có thể thấy rằng việc nghiên cứu chủng E. ictaluri bị ñột biến gen cho
mục ñịch tạo vaccine sống nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra ở Việt Nam chỉ
mới ñược bắt ñầu từ năm 2010 khi chính phủ khởi ñộng chương trình ứng dụng công
nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản. Cho ñến nay, chưa có công trình và sản phẩm
nào trong nước công bố về vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra do E.
ictaluri gây ra.
1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi

o

thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau 48 giờ nuôi cấy ở 28 C, vi khuẩn tạo nên khuẩn
lạc hình tròn, bóng có kích thước khoảng 2 mm, màu trắng, không có nhân, rìa có dạng
không ñồng nhất [3], [24], [42]. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn hình que,
gram âm, phần lớn ở dạng ñơn, ñôi và một số dạng chuỗi, kích thước khoảng 0,75 x
o

2,5 µm ở 26oC [28], chuỗi vi khuẩn kéo dài 5-7 µm khi ở 37 C [39] hoặc có thể biến
thiên 1,2-15 µm [54]. Vi khuẩn có khả năng chuyển ñộng bằng tiêm mao, di ñộng yếu
ở 25-30oC nhưng không di ñộng ở nhiệt ñộ cao hơn [40].
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng phát triển tốt ở khoảng nhiệt ñộ tối
ưu 22 – 28oC [41]. pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,0 – 7,5 và phát triển tốt
nhất trong môi trường có nồng ñộ muối là 0,5%, nhưng không chịu ñược ñộ muối cao
hơn 1,5% [39], [40]. E. ictaluri thường ñược phân lập từ môi trường nuôi, từ nội quan
hoặc mô não cá bị bệnh. Trong môi trường nước, vi khuẩn E. ictaluri có thể tồn tại
khoảng 9 ngày [41], còn trong môi trường bùn, ñáy ao vi khuẩn E. ictaluri có khả năng
tồn tại trong vòng 1 tháng [26] ñến 95 ngày khi ở nhiệt ñộ lạnh [30], [41].
Vi khuẩn E. ictaluri có khả năng sử dụng D-glucose và một số ñường khác kết
quả sinh ra a xít và thường sinh hơi. Oxidase âm tính, catalase dương tính, Vogesproskauer và simmon citrate âm tính, LDC dương tính, ODC dương tính, khử Nitrate
thành Nitrite. Vi khuẩn cho phản ứng destrose, dulcitol, fructose, galactose, maltose,
mannose và salicin dương tính. Ngoài ra, E. ictaluri cũng cho kết quả dương tính với
lysine, ornithine,glucose, mannitol và mellibiose [29], [33]. Vi khuẩn này là nguyên
nhân gây bệnh ở cá da trơn (catfish) và một số ñộng vật khác, hiếm khi là là tác nhân
gây bệnh cơ hội cho người.


8
1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E.
ictaluri



9
Minh vào ngày 11/8/2009: Vi khuẩn E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan
thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam [11]. Thêm vào ñó, nhóm nghiên cứu của
Crumlish (ðại học Stirling-Anh) khẳng ñịnh rằng chủng vi khuẩn E.ictaluri ở Hoa Kỳ
và chủng vi khuẩn E. ictaluri ở Việt Nam có một số sai khác ñáng kể [24].
Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri có thể có hoặc không xuất hiện
dấu hiệu bất thường ở bên ngoài. ða số thể hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở các gốc vây,
xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trắng mang (mang nhợt nhạt,
tiết nhiều nhớt). Giải phẫu nội tạng cho thấy 100% cá bệnh ñều tồn tại của các ñốm
trắng có ñường kính 0,5-3,0mm ở các tổ chức nội tạng như gan, thận, lá lách. Các ñốm
trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, làm thận sưng to gấp 2-3 lần bình thường và
mềm nhũn, khi bệnh nặng mới có thể quan sát thấy ở tỳ tạng và gan, các ñốm trắng ở
gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [6].
Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở ñồng bằng sông Cửu Long xuất
hiện hàng năm và theo mùa vụ, thường vào tháng 8-11 trong ñó ñỉnh cao nhất vào
tháng 9 [10]. Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá tra ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất
và gây chết nhiều nhất ở cá tra dưới 3 tháng tuổi [10]. Việc phòng và trị bệnh do vi
khuẩn E. ictaluri cho cá tra hiện nay ở Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và
hóa chất. Phần lớn khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sử dụng nhiều loại kháng
sinh kết hợp nhằm ñiều trị có hiệu quả cho tất cả các bệnh nhiễm khuẩn nói chung.
Việc sử dụng thuốc như vậy dẫn ñến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia
tăng, ñồng thời gây ảnh hưởng lớn ñến chất lượng thực phẩm và gây ô nhiễm môi
trường [10]. Do vậy, phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn ñề ñược ñặt
ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay.
Những nghiên cứu về cơ chế xâm nhập của vi khuẩn E. ictaluri vào trong dạ dày
của cá cho thấy: E. ictaluri xâm nhập vào lớp biểu mô, sau ñó ñược thực bào bởi các
ñại thực bào ngoại vi nằm dưới lớp biểu mô [21], [37], [50]. Tuy nhiên, lại không phát
hiện thấy các tổn thương ở vùng tế bào biểu mô nên người ta cho rằng E. ictaluri

vỏ

capsule,

các

hemolysin,

lypopolysaccharide và một số enzyme chondroitin sulfate [23]. Tương tự với các
chủng vi khuẩn gây bệnh khác, E. ictaluri có thể tạo ra lớp polysaccharide dày giống
như chất nhày bao phủ các protein kháng nguyên giúp vi khuẩn tránh khỏi sự ñáp ứng
miễn dịch của tế bào vật chủ [35]. Màng tế bào E. ictaluri có liên ñới với các
hemolysin, nhưng hemolysin không phải là nhân tố gây ñộc quan trọng ở cá tra [53].
Theo Lawwrence và cộng sự (2003), lypopolysaccharide (LPS) ñược xem như là nhân
tố gây ñộc chính của E. ictaluri [35]. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri có LPS có khả
năng kháng ñối với sự phân hủy tế bào vi khuẩn bởi hệ thống bổ thể hoặc quá trình
thực bào tốt hơn các chủng thiếu LPS [35]. Cooper và cộng sự (1996) cho rằng hoạt
tính chondroitinase cũng góp phần vào ñộc tính của E. ictaluri [23].

Hoạt tính

chondroitinase phân giải mô sụn tạo nên những lỗ thủng trên ñầu cá (thườn goi là triệu
trứng “hole in the head”) [23].
E. ictaluri tồn tại trong các lớp chất ñáy ao hồ tới 95 ngày ở nhiệt ñộ lạnh [33],
[41]. Vì vậy, dưới những ñiều kiện tối ưu, nó có thể cảm nhiễm vào cá ở mọi lứa tuổi
[26]. Sự lây nhiễm theo trục ngang của bệnh có thể diễn ra thông qua sự phát tán vi
khuẩn vào môi trường nước nuôi bởi các cá thể cá bị nhiễm bệnh hoặc do sự ăn thịt lẫn
nhau giữa cá khỏe với cá bị bệnh [30]. Ngoài ra, chim và các trang thiết bị từ các ao/bể
cá bị bệnh cũng góp phần vào sự lan truyền bệnh giữa các ao/hồ hoặc giữa các trại cá
[30].

mủ ở ñồng bằng song Cửu Long Việt Nam ñược xác ñịnh là kháng lại với một số loại
thuốc kháng sinh thông thường và rất có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh xuất huyết
nội tạng (ESC) trên cá nheo Mỹ như: Oxytetracylin, oxonilic acid, sulphonamid [3],
[10], [24]; bactrime, colostin, amoxicillin, tetracylin, doxycyclin [8].


12
Từ Thanh Dung và cộng sự (2008, 2010) khảo sát tính kháng kháng sinh của
chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ñồng bằng song Cửu Long cho
thấy vi khuẩn ñã có hiện tượng kháng thuốc ñáp ứng với kháng sinh streptomycin
(83% trong số 64 chủng ñã kháng thuốc), trimethoprim (71% trong tổng số 64 chủng
ñã kháng thuốc), tetracycline (64% trong tổng số 50 chủng ñã kháng thuốc), doxycylin
(56% trong tổng số 50 chủng) và có trên 705 trong tổng số 50 chủng E. ictaluri kháng
với thuốc kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol và florfenicol) [4], [25]. ðồng
thời kết quả cũng ñã xác ñịnh nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC) khá cao (MIC90
128µg/ml) cũng ñã thể hiện tính kháng cao của vi khuẩn ñối với nhóm kháng sinh
phenicol. Vi khuẩn này ñã bắt ñầu có hiện tượng kháng với nhóm quinolone như:
flumequin và enrofloxacin ở mức giá trị MIC50 là 4 µg/ml và MIC90 là 64 µg/ml;
streptomycin với giá trị MIC90 ≥ µg/ml, chloramphenicol, enrofloxacine MIC90 (128
µg/ml) và oxytetracyline với giá trị MIC90 (64 µg/ml) [4], [25].
Ngoài ra, hiện tượng ña kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn E. ictaluri cũng ñang
là mối lo không chỉ của người nuôi mà còn là mối lo ñối với các nhà quản lý sức khỏe
cộng ñồng bởi nó không chỉ làm giảm hiệu quả ñiều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ
ñối với sức khỏe con người, nhất là các kháng sinh ñã bị cấm. Nghiên cứu của nhóm
tác giả ðại học Cần Thơ năm 2010 cho thấy có ñến 86% chủng vi khuẩn E. ictaluri thể
hiện tính ña kháng. Trong ñó vi khuẩn kháng ñồng thời với 8 loại kháng sinh chiếm tỉ
lệ 20,9%, với 9 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ 11,6%; có 73% trong tổng số 64 chủng E.
ictaluri khảo sát ña kháng sinh với ít nhất 3 loại kháng sinh.
Tóm lại, những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học của chủng E. ictaluri cho thấy
vi khuẩn E. ictaluri gây nhiễm trùng máu trên cá nheo ở Hoa Kỳ, cá trê trắng ở Thái

ñược bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp thì mới có thể sống ñược [37]. ðối với chủng
vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen purA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là adenine. ðối
với chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen aroA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là
chorismate. Hàm lượng adenine cung cấp tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
25 µg/ml adenine ñối với môi trường DMM [37], 50 µg/ml adenine ñối với môi trường
BHIB, [11]. Ngoài ra, Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) , Trần Thị Bích Thủy
(2012) sử dụng các môi trường BHIB, LB và EIM ñể nuôi cấy tăng sinh chủng vi
khuẩn E. ictaluri sau khi ñột biến gen purA, aroA và ch, sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C
cho thấy vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến có khả năng phát triển trên các môi trường
này [2], [17].
Tóm lại, những nghiên cứu về môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn E. ictaluri
hoang dại (chưa ñột biến) và chủng vi khuẩn E. ictaluri bị ñột biến gen cho thấy chúng
có sự tương ñồng nhau. Ngoại trừ một số chủng bị ñột biến gen khuyết dưỡng thì cần
phải ñược bổ sung dinh dưỡng trước khi tiến hành nuôi cấy.


14
1.4. Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E. ictaluri hiện nay trên Thế
giới và Việt Nam.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau, tuy nhiên với
vi khuẩn E. ictaluri thì có một số phương pháp sau thường ñược nhiều người sử dụng.
1.4.1. Phương pháp bảo quản thạch nghiêng
ðây là phương pháp khả phổ biến, rất ñơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian
lưu giữ lại khá ngắn, sau ñó phải cấy truyền lại trên môi trường thạch mới. Do phải
cấy truyền nhiều lần nên tốn khá nhiều công sức và chủng cũng dễ bị mất ñi các ñặc
tính di truyền ban ñầu.
1.4.2. Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng
Phương pháp này ñã ñược Lumiere và Chevotier ñề nghị ñầu tiên năm 1914,
tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng nhưng ñể ngăn cản vi khuẩn
phát triển, phủ một lớp dầu khoáng lên trên mặt môi trường thạch nghiêng, làm vi