TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
*********
NGUYỄN THỊ PHƢƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG ĐẤT TRỒNG
KHU VỰC XUÂN HÒA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. DƢƠNG MINH LAM
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG
HÀ NỘI, 2012
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và
TS. Dương Minh Lam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và
hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Khắc Thanh và các cán bộ phòng thí
nghiệm Vi sinh học, Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN, Bộ môn Vi sinh vật học đã tạo điều kiện cho tôi
được học tập và hoàn thành đề tài này.
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu......................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài........................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn ............................................................................... 5
1.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ................................................. 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................................ 6
1.1.3. Cấu tạo xạ khuẩn ..................................................................................... 7
1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn ............................................................................... 9
1.2. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại ........................................ 10
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .............................................. 10
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại ....................................................................... 11
1.2.3. Đặc điểm sinh lý , sinh hóa ................................................................... 12
1.2.4. Phân loại số ........................................................................................... 12
1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn ........................................................... 13
1.3.1. Nhu cầu cacbon ..................................................................................... 14
1.3.2. Nhu cầu nitơ .......................................................................................... 14
1.3.3. Nhu cầu vitamin và chất khoáng ........................................................... 15
1.4. Cellulose và Cellulase .............................................................................. 15
1.4.1. Cellulose ............................................................................................... 15
1.4.2. Hệ thống cellulase ................................................................................. 19
1.4.3. Cơ chế phân giải cellulose .................................................................... 20
1.4.4. Ứng dụng của cellulase ......................................................................... 22
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu. ............................................................................................. 27
2.1.1. Vi sinh vật ............................................................................................. 27
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VSV:
: Vi sinh vật
HSCC
: Hệ sợi cơ chất
HSKS
: Hệ sợi khí sinh
AND
: Deoxyribonucleic Acid
ARN
: Ribonucleic Acid
ADP
: Diaminopimelic Acid
C1
Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông
nghiệp phổ biến.
Bảng 3.1.
Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng
Bảng 3.2.
Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Bảng 3.3.
Khả năng chịu muối của 4 chủng T5, T7, T9, T13.
Bảng 3.4.
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7,
T9, T13
Bảng 3.5.
Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7,
T9, T13
Bảng 3.6.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase
của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Một số hình ảnh xạ khuẩn
Hình 3.3.
Hình ảnh hệ sợi và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu
Hình 3.4.
Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng T5
Hình 3.5.
Môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên
Hình 3.6.
Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn trên môi chứa nguồn
cacbon tự nhiên
Hình 3.7.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính cellulase của các chủng
xạ khuẩn nghiên cứu
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong quá trình sống của thế giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa
phẩm, thuộc da, dệt, phim ảnh, y học (chữa bệnh và phân tích hóa sinh ), bảo
vệ môi trường…Ở nước ta, nghành công nghiệp enzyme đã được hình thành
và hy vọng rằng trong tương lai không xa sẽ được phát triển cùng với trào lưu
chung của công nghiệp và hiện đại hóa đất nước.
Cellulose là thành phần chủ yếu tạo nên bộ khung xương tế bào thực vật.
Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây xanh
tổng hợp trên trái đất trong đó có 30% là thành tế bào thực vật, thành phần
chủ yếu của thành là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một lượng
chất thải khổng lồ (chất thải công nghiệp, chất thải sinh hoạt, chất thải thực
vật như lá, cành…). Thành phần chủ yếu của các loại chất thải này là
cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật đất đóng vai
trò rất quan trọng đặc biệt là các chủng vi sinh vật có hệ enzyme cellulase có
tác dụng phân giải cellulose.
Từ những lí do trên cùng với việc tận dụng khả năng phân giải cellulose
của các chủng xạ khuẩn trong đất tôi đã lựa chọn và nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc”.
2. Mục tiêu
2.1.
Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa.
2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính
enzyme cellulase mạnh nhất.
2
3. Nội dung nghiên cứu
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức
độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số vi sinh vật [20].
Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi lớn về
số lượng xạ khuẩn trong đất, số lượng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng
cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lượng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào
mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật…Đất
giàu dinh dưỡng hữu cơ, khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo
dinh dưỡng. Trong 1g đất canh tác có thể phân lập được 5.000.000 CFU/g xạ
khuẩn. Đất vùng xa mạc khô nóng, nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít
hơn, dao động trong khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g.
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6.8 –
7,5. Đồng thời số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện như
thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ...
4
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử). Hệ thống sợi xạ
khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 –
1,0µm đến 2,0 – 3,0µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [4].
chủ yếu là dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố
này thường có màu sắc khác với màu sắc của HSKS. Đây cũng là đặc điểm
phân loại xạ khuẩn quan trọng.
Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề
mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trường khi cấy chuyền. Loại chỉ
có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trường hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy
lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông
hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những
quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1mm đến 2- 3mm [3].
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ
cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng sợi, dày 10 – 20 nm có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp
ngoài cùng dày khoảng 60 – 120A0, khi già có thể đạt tới 150 – 200A0, lớp
giữa rắn chắc dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50 A0. Các lớp này chủ
yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – acetylglucozamin
6
liên kết với N – acetylmuramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozid. Khi sử lý
bằng lyzozyme, các liên kết 1,4 – β glucozid bị cắt đứt, thành tế bào bị phá
hủy tạo thành thể sinh chất ( protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi sử
lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hòa tan lipid khác.
Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS
chọn.
1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ
phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc
làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose,
mùn, kitin, keratin, lignin…[15]
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
xạ khuẩn hiếm như Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú
y học, bảo vệ thực vật như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin,
tetraxicline… Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn có thể sản
sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó điển hình là các enzyme ngoại bào
(cellulase, protease…), vitamin nhóm B (B1, B2,…, B12), một số axit hữu cơ
(acid lactate, acid acetate…)[15].
Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong nghành công nghiệp
lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời
sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như
protease, amylase, cellulase, kitinase…Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trưởng cho thực vật.
8
1.2. Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lí sinh
học… nên việc định tên một số loại xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu
+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA- RF (Rectinaculum Apertum- Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử
có móc hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu RF ( Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết
xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp
xếp lại trong phân tử AND. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau
về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ
tiêu bổ sung như các đặc điểm sinh lý- sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học
phân tử.
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20
năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và hiệu quả thông qua việc định
tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật.
Type thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào
Type Peptidoglican (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptid của PG cầu nối peptid và các liên kết giữa các mắt
xích của PG.
Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Cornebacter. Đây là đặc điểm
phân loại cơ bản cho các chi đó.
10
Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch
thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu Iso và Entiso metyl hóa ở
hệ số giống nhau (hệ số S – Similarity).
Công thức của Jacard ( Sj ):
Sj(AB) = NS * 100 / (NS + Nd)
Trong đó
Sj(AB): Mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)
NS : Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so
sánh.
Nd : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính ở
chủng này và âm tính ở chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu rễ
cây) của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được
xếp vào một nhóm.
1.3. Nhu cầu dinh dƣỡng của xạ khuẩn
Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa của các VSV có quan
hệ mật thiết đối với các yếu tố của điều kiện sống. VSV cần ở tự nhiên hay
môi trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh dưỡng để xây dựng nên các hợp chất
của tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng [3].
Nhu cầu dinh dưỡng của các VSV rất khác nhau. Ngay trong cùng một
loài VSV nhu cầu này cũng không có có sự thống nhất. Giống như các loài
VSV khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. Trong
công nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh
dưỡng thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất. Ví dụ nuôi cấy thu
enzyme cellulase người ta quan tâm đến nguồn cabon. Nhưng nếu mục đích
sản xuất là làm thế nào để thu được một lượng lớn chất kháng sinh nào đó thì
người ta lại quan tâm đến nguồn nitơ.
12
Phần lớn các loài xạ khuẩn đều có đời sống dị dưỡng nitơ. Chỉ một số loài
thuộc chi Frankraceae có khả năng cố định nitơ nhờ sống cộng sinh với rễ cây
họ đậu.
1.3.3. Nhu cầu vitamin và chất khoáng
Vitamin và chất khoáng đóng vai trò không nhỏ trong quá trình sống của
VSV. Trong tế bào VSV ngoài nước, các chất hữu cơ còn có một lượng lớn
các vitamin và chất khoáng lượng chất này trong tế bào thay đổi theo tùy loài.
Tùy giai đoạn, điều kiện sinh trưởng mỗi yếu tố đều có tác động nhất định đối
với sự phát triển của tế bào VSV mà các nhân tố khác không thể thay thế
được.
Nguyên tố khoáng được chia làm 2 loại:
Nguyên tố đa lượng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl...
Nguyên tố vi lượng: Mn, Cu, Co, B...
1.4. Cellulose và Cellulase
1.4.1.Cellulose
Thành phần chất khô chủ yếu của thực vật là hemicellulose và lignin.
Các thành phần này thường có tỉ lệ không giống nhau ở các loại cây khác
nhau. Chúng phối hợp tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học cà cơ
lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp phần này thường đi liền
với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose .
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Tổng lượng của
chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên trái đất. Về cấu trúc hoá học
của cellulose là một polyme mạch thẳng do các D - glucopyranose liên kết với
nhau bằng liên kết β -1,4glucozid. Các đơn phân glucose trong cellulose có
cấu hình dạng ghế, quay một góc 180° so với phân tử trước nó. Các nhóm
hydroxyl này đều nằm trên một mặt phẳng nằm ngang.
14
20 – 35
Coniferyl alcohol
ρ – counmaryl alcohol
Synapyl alcohol
Cấu trúc
đa phân tử
β – 0 – 4 liên kết
mạch thẳng
Các
enzyme có
hoạt tính
phân giải
Endoglucanlase
( E.C.3.2.1.4 )
Cellobiohydrolase
( E. C.3.2.1.91)
β – Glucosidase
Khử hydro trùng hợp thành
chất không kết tinh
Lignin peroxidase
( E. C. 1.11. 1. 7)
Mn phụ thuộc vào
peroxidase
(E.C.1.11.1.7)
ngờ ngay trong vùng có độ kết tinh cao.
16
Copyright: Tài liệu đại học ©