ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC KHOA HọC

PHùNG HUY TRọNG NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM SINH HọC
MộT Số CHủNG Baccillus thuringiensis
SINH PROTEIN TINH THể DIệT CÔN TRùNG
Bộ CáNH CứNG
LUậN VĂN THạC Sĩ CÔNG NGHệ SINH HọC
THáI NGUYÊN - 2013

ii LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự
giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng
cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó.
Trƣớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ngô Đình Bính, ngƣời
thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận
văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán
bộ phòng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các
giảng viên cùng các thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong suốt thời thời gian học tập tại trƣờng và hoàn thành tốt luận văn
của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những ngƣời đã luôn ủng
hộ tôi trong suốt thời gian qua!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013
Học viên Phùng Huy Trọng
tenebrionis 20
1.2.1. Một số đặc điểm về gen cry3 20
1.2.2. Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis
subsp. tenebrionis 21
1.3. Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) 22
1.4. Tách dòng gen 26
1.4.1. Khái niệm 26
1.4.2. Vectơ tách dòng 26
iv PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28
2.1. Vật liệu 28
2.1.1. Sinh phẩm 28
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 28
2.1.3. Môi trƣờng 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 31
2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh 31
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 32
2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt 33
2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A 34
2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A 34
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen
cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng. 38
3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 38
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis 39
3.2. Kết quả phân loại dƣới loài bằng phƣơng pháp huyết thanh 40
3.3. Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 41

Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis
5
DNA
Deoxyribonucleotide acid
6
E. coli
Escherichia coli
7
EDTA
Ethylene diamine tetra - acetic acid
8
LB
Môi trƣờng Lauria Betani
9
PCR
Polymerase chain reaction
10
SDS
Sodium dodecyl sulphate
11
Sol
Solution
12
TAE
Tris - Acetate - EDTA
13
X- gal
5 - Bromo - 4 Cloro - 3 indolyl ß - d galactoside
14
kDa

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6
Hình 1.3. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 18
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein Cry3A 21
Hình 1.5. Một số hình ảnh về côn trùng bộ cánh cứng 22
Hình 1.6. Ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành 23
Hình 1.7. Chu kỳ sống và phát triển của mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) . 25
Hình 1.8. Vectơ tách dòng pGEM - T easy 27
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng
MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 28
0
C sau 3 ngày 38
Hình 3.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập đƣợc khi nhuộm fushin
và soi dƣới kính hiển vi điện tử. 39
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết
thanh dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 41
Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của
các chủng Bt phân lập…………………………………………………………43
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 43
Hình 3.6. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi
cấy qua đêm. 44
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc
ĐNT 9.5 trên agarose 1%. 46
Hình 3.8. Kết quả PCR DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5
đã biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A 47
Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình
tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1 49 1


2 tiêu diệt hiện nay. Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết sức cần thiết. Xuất
phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis
sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng”.
Mục tiêu đề tài:
- Tuyển chọn đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis có hoạt
tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành (Tribolium castaneum) cao.
- Xác định đƣợc trình tự gen cry3A từ các chủng Bt subsp. tenebrionis đã tuyển
chọn.
Nhiệm vụ của đề tài:
- Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang
và Quảng Nam.
- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành.
- Phát hiện gen cry3A bằng phƣơng pháp PCR.
- Tách dòng gen cry3A mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng.
- Xác định trình tự đoạn gen cry3A và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen
quốc tế.


israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã
chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy
(Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera).
4 Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại đƣợc nâng lên khi Krieg và cộng sự
phát hiện ra dƣới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera).
Chủng này đƣợc phân lập từ bộ cánh cứng Tenebrio molitar.
Năm 1985, gen cry của Bt đƣợc chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến
năm 1995 các cây chuyển gen đầu tiên đã đƣợc đƣa vào sản xuất và ứng dụng.
Từ năm 1987-1992, ngƣời ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt
giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ
Hymenoptera.
Năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất,
từ đó mở ra một chƣơng mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp,
cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen [1].
Năm 2003, Sakai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào
ung thƣ.
Năm 2005, Ohba M và Binh, N.D. đã phát hiện protein của 4 dƣới loài Bt
phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thƣ cổ tử cung của ngƣời [45].
Trên thế giới từ lúc phát hiện ra vi khuẩn Bt mang gen mã hóa tinh thể
protein diệt côn trùng, đã có rất nhiều nghiên cứu và ngày càng phát hiện ra
nhiều gen cry mới góp phần vào sự đa dạng của ngân hàng gen Bt thế giới.
1.1.1.2. Ở Việt Nam
Việt nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringensis (Bt) các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong
nghiên cứu, sản xuất và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời
sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp.

bào.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis
6 Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn
lạc nhăn, đƣờng kính có thể đạt tới 8-10 m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn
lạc dạng trơn nhẵn.
Mỗi tế bào Bt khi trƣởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc
có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng. Bào tử có dạng hình trụ hoặc
hình trứng, kích thƣớc 1,6-2 m. Bào tử đƣợc hình thành trong điều kiện môi
trƣờng bất lợi nhƣ nhiệt độ cao, môi trƣờng nghèo chất dinh dƣỡng… Khi gặp
điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dƣỡng.
Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng đƣợc tổng
hợp. Tinh thể có kích thƣớc 0,6-2 m, có hình dạng không cố định có thể là
hình lập phƣơng, hình lƣỡng tháp hoặc hình cầu. Tinh thể có thể chiếm tới 30%
trọng lƣợng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và
quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử
thì bắt màu hồng nhạt [1, 3, 4].

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus
Các loài thuộc nhóm B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B.
anthracis, B. mycoides, B. megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B.
weihenstephanensis và B. pseudomycoides [19]. Việc sinh ra protein tinh
thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là
một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại
Bào tử
Tinh thể

(c)

-
+/-
Phản ứng khử nitrate
+
+/
+
+
-
(d)

Phân hủy tyrosine
+
+
+/-
-
(d)

+/-
Kháng lysozyme
+
+
+
+
-
Phản ứng với lòng đỏ
trứng
+
+

-
+
-
-
-
Chú thích:
a
+: 90-100% số chủng phản ứng dƣơng tính

b
+/-: 50-50% số chủng phản ứng dƣơng tính
c
-: 90-100% số chủng phản ứng âm tính
d
-: hầu hết các chủng phản ứng âm tính
Bc: Bacillus cereus
Bt: Bacillus thuringiensis
Bmy: Bacillus mycoides
Ba: Bacillus anthracis
Bme: Bacillus megaterium

1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Bt không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinose,
xylose, manitol, nhƣng tạo axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose. Có khả
năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có
chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng
gà. Không có khả năng khử amin của phenylalamin, không sử dụng axit citric,
không khử muối sulphate.
8


thuringiensis đặt tại viện Pasteur ở Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các
phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [2].
9 Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào
kháng nguyên tiên mao H
Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
1
Thuringiensis
THU
Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958
2
Finitimus
FIN
Heimpel & Angus 1958
3a, 3c
Alesti
ALE
Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus
1958
3a, 3b, 3c
Kurstaki
KUR
de Barjac & Lemille 1970

Aizawai
AIZ
Bonnefoi & de Barjac 1963
8a, 8b
Morrisoni
MOR
Bonnefoi & de Barjac 1963
8a, 8c
Ostriniae
OST
Ren et al. 1975
8b, 8d
Nigeriensis
NIG
Weiser & Prasertphon 1984
9
Tolworthi
TOL
Norris 1964; de Barjac & Bonnefoi 1968
10a, 10b
Darmstadiensis
DAR
Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968
10a, 10c
Londrina
LON
Arantes et al. (Không công bố)
10
De Lucca, Simonson & Larson 1979
16
Indiana
IND
De Lucca, Simonson & Larson 1979
17
Tohokuensis
TOH
Ohba, Aizawa & Shimizu 1981
18a, 18b
kumamotoensis
KUM
Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981
18a, 18c
Yosoo
YOS
Lee, H. H et al. 1995
19
Tochigiensis
TOC
Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981
20a, 20b
Yunnanensis
YUN
Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei
1979
20a, 20c
pondicheriensis
PON
Rajagopalan et al. (Không công bố)

thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
26
Silo
SIL
de Barjac and Lecadet (Không công bố)
27
Mexicanensis
MEX
Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không
công bố)
28a, 28b
Monterrey
MON
Rodriguez-Padilla et al. (Không công bố)
28a, 28c
Jegathesan
JEG
Seleena, Lee, H. L. & Lecadet 1995
29
Amagiensis
AMA
Ohba (Không công bố)
30
Medellin
MED
Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac
1992
31

OSW
Rabinovitch et al. 1995
39
Brasiliensis
BRA
Rabinovitch et al. 1995
40
Huazhongensis
HUA
Dai Jingyuan et al. 1996
41
Sooncheon
SOO
Lee H. H et al. 1995
42
Jinghongiensis
JIN
Li Rong Sen et al. (in press)
12 Kháng
nguyên H
Thứ huyết
thanh
Code
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu
43
Guiyangiensis
GUI

51
Xiaguangiensis
XIA
Jian Ping Yan (Không công bố)
52
Kim
KIM
Kim et al. (Không công bố)
53
Asturiensis
AST
Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez
1996
54
Poloniensis
POL
Damgaard et al. (Không công bố)
55
palmanyolensis
PAL
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố )
56
Rongseni
RON
Li Rong Sen (in press)
57
Pirenaica
PIR
Caballero et al. (Không công bố)
58

BOL
Ferrộ-Manzanero et al. (Không công bố)
64
Azorensis
AZO
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
65
Pulsiensis
PUL
Khalique F. and Khalique A. (Không công
bố)
66
Graciosensis
GRA
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
67
Vazensis
VAZ
Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)
68
Thailandensis
THA
Chanpaisaeng et al. (Không công bố)
69
Pahangi
PAH
Seleena and Lee H. L. (Không công bố)

1.1.6. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng
Kích thƣớc hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4 -

cry khác nhau thuộc về 70 nhóm (từ cry1 - cry72). Mỗi nhóm gen lại có những
đặc điểm và đặc tính khác nhau [44].
Bảng 1.2. Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng
Gen
Hình dạng tinh
thể
Trọng lƣợng phân
tử protein (kDa)
Hoạt tính diệt côn trùng
cry1A - 1M

Lƣỡng tháp
130 - 138
Cánh vảy Lepidoptera
cry2A -cry2C
Cầu
69 - 71
Cánh vảy Lepidoptera/
Hai cánh Diptera
cry3A -cry3C
Lập phƣơng
73 - 74
Cánh cứng Coleoptera
cry4A-cry4D
Cầu
73 - 134
Hai cánh Diptera
cry5A-cry5E
Lƣỡng tháp
81

fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng mẫn cảm do ăn phải độc tố, Vip3A
là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa.
1.1.8. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis
Bt có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố.
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Ngoại độc tố  ( - exotoxin)
Nội độc tố  ( - endotoxin)
Trong đó nội độc tố  có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất.
16 1.1.8.1. Ngoại độc tố 
Có khối lƣợng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong
nƣớc, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và đƣợc giải phóng ra môi
trƣờng khi tế bào tan rã.
Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là photpholipase hoặc
leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá. Tác dụng độc của ngoại
độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ photpholipid ở mô của côn trùng. Nghiên
cứu này đƣợc phát hiện bởi Toumanoff năm 1953.
1.1.8.2.Ngoại độc tố 
Có trọng lƣợng phân tử thấp 707 - 850 kDa, là độc tố bền nhiệt, tan
trong nƣớc. Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm nuclease và RNA-polymease
dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại độc tố  có phổ hoạt tính rộng, có
hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn
trùng thuộc bộ hai cánh.
Qua nghiên cứu Brian Federici và Dongwu cũng nhận thấy rằng chế
phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20%
trong khi đó nếu bổ sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng
lên tới 75%.

thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hƣởng tới độc tính của tinh
thể. Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hoà tan trong pH rất kiềm.
Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần nhƣ đồng thời trong khoảng 3 giờ
sau pha cân bằng.
1.1.9. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng
Cơ chế tác động của protein tinh thể của Bacillus thuringiensis liên quan
tới sự hoà tan của tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Các tinh thể độc đều
đƣợc bắt nguồn từ một protein có khối lƣợng phân tử lớn khoảng 130-140 kDa,
đƣợc gọi là “tiền độc tố”. Tiền độc tố này phải đƣợc hoạt hoá thì mới gây ra
tính độc. Trong những điều kiện bình thƣờng thì protein tinh thể không bị hoà
tan, do vậy nó rất an toàn với ngƣời và động vật bậc cao. Tuy nhiên trong môi
trƣờng pH cao (khoảng 9,5), protein tinh thể sẽ bị hoà tan. Môi trƣờng pH này
thƣờng thấy trong ruột giữa của ấu trùng thuộc bộ cánh vảy. Với lý do này, Bt
đƣợc xem là một tác nhân diệt côn trùng có tính đặc hiệu cao [16].
Tinh thể độc gây độc lên côn trùng thông qua con đƣờng tiêu hoá. Nhờ
có hệ Enzyme protease và môi trƣờng pH kiềm ở ruột giữa của côn trùng mà
tinh thể độc sẽ bị hoà tan. Quá trình hoà tan này phụ thuộc vào pH của môi
trƣờng và thành phần cấu tạo của tinh thể. Khi tan nó sẽ tạo ra các mảnh độc có
khối lƣợng phân tử nhỏ. Các mảnh độc này sẽ gắn với các thụ thể có ở trên
màng biểu mô của tế bào ruột làm thủng tế bào. Kết quả là ruột bị tê liệt, ấu

Trích đoạn Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ Kết quả tách dòng gen cry3A

---