Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN
TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Hà Nội, 2012



Nguyễn Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt 6
1.1.3. Đặc điểm sinh hoá 8
1.1.4. Đặc điểm phân loại 8
1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9
1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 11
1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 13
1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 14
1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam 15
1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 16
1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai 18
1.2. Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy 19
1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy 19
1.2.2. Côn trùng thử nghiệm 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

STT
Viết tắt
Viết đầy đủ
1
Amp
Ampicillin
2
Bp
Base pair
3
Bt
Bacillus thuringiensis
4
Bta
Bacillus thuringiensis subspecies aizawai
5
dH
2
O
Nước khử ion
6
DNA
Deoxyribonucleotide acid
7
E. coli
Escherichia coli
8
EDTA

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis …………………… …. 7
Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac 14
Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis …… ………… 15
Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….…… 21
Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại …………… …………………………… 21
Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng …………… ……… ……………. 23
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC 33
Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . 34
Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển
vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………… 36
Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 37
Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu……………… 38
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… 39
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua
đêm………………………………………………………………………………. 41
Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… 42
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên
agarose 1% 43
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều
kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng
bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên
180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt
hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà.

1.2. Nội dung
- Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái
Nguyên.
- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương
pháp huyết thanh học.
- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được.
- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn
trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR.
- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy.
- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình
tự gene trên Gene Bank.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis
 Trên thế giới
B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học
Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu,
đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi
Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8].
Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây
bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã
đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8].
Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục
thân ở Châu Âu.
Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa
mì tại Pháp.
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương
mại cao [10, 13, 25].
Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản
xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –
cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2].
Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả
năng diệt tế bào ung thư.
Năm 2005, Ohba và N.D. Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt
phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung
ở người [10,13].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng
để sản xuất có tính thương mại cao.
 Ở Việt Nam
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam
được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác
giả như Nguyễ n Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu
tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam [10].
Thời kỳ mở đầu nghiên cứu
Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn rất
ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis
bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng
các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var.
thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã
được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả
tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã
bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lượng
không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10].

đầu từ cuối thế kỷ 20. Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu
vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các
giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. [9,13].
Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua
phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gene kháng sâu trên được
chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt
Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh
vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que,
kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí
không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc
trên bề mặt tế bào [26,27,28].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn
lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn
lạc dạng trơn nhẵn.
Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc
bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc
hình trứng, kích thước 1,6-2m. Bào tử được hình thành trong điều kiện môi
trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp
điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27].

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]
Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng
hợp. Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là
hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có thể chiếm tới 30%
trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và
quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn
chế.
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có
hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh
động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H
được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương pháp phân
loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi
khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type huyết thanh và các
chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập
được. Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao
gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B. thuringiensis. Theo hệ thống phân loại
thì B. thuringiensis subsp. aizawai thuộc type huyết thanh số 7 (Theo Bonnefoi
& de Barjac 1963) [5].
Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B.
thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các
phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H.
1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Kích thước hệ gene của B. thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp. Thể
nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình
dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen
có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có một NST duy nhất dạng
vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt.
Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài
nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không
đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên
cho một số chủng B. thuringiensis.

cry2A- cry2C
Cầu
69 – 71
Cánh vảy, hai cánh
cry3A- cry3C
Lập phương
73 – 74
Cánh cứng
cry4A- cry4D
Cầu
73 – 74
Hai cánh
cry5
Lưỡng tháp
81
Tuyến trùng
cry8
Lập phương
130
Cánh cứng
Các gene cry còn lại
Đa dạng
35 – 129
Đa dạng
Gene cyt
Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình
thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố là
không đáng kể [34].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Toumanoff - năm 1953) [8, 11].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella. Ngoài ra còn có
hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng.
Ngoại độc tố


Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi
nhà bằng thức ăn có chứa B. thuringiensis. Độc tố  có khối lượng phân tử cao
707- 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm
nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại độc tố
 có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ
cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh [8,12].
Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng
mẫn cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu
trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết.
Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử
dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ
sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%.
Ngoại độc tố


Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không
khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có tác
dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở
nhiệt độ từ 60
0
C trở lên trong vòng từ 10- 15 phút đã bị vô hoạt.

khoảng 3 giờ sau pha cân bằng [8, 11, 16].
1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể
Năm 1991, Li và cs đã công bố cấu trúc của nội độc tố  của protein tinh
thể diệt sâu Cry3A, từ đó đã mở rộng ra cho các độc tố khác. Các protein tinh
thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:
Vùng 1: là một chuỗi polypeptide gồm 290 amino acid, đây là vùng đầu
N. Vùng này gồm 7 chuỗi xoắn , 6 trong 7 chuỗi này được sắp xếp thành hình
6 cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ 5 kị nước. Mặt bên của chuỗi xoắn
thứ nhất và thứ 7 là các amino acid kị nước và nó nằm liền kề với vùng 2.
Vùng 2: bắt đầu từ amino acid 291 đến amino acid 500. Vùng này gồm 3
tấm  có cấu trúc tương đồng, song song và xếp ngược chiều nhau, trong đó tấm
1 và tấm 2 có tính tương đồng cao hơn. Mỗi tấm bao gồm 4 mảnh  không song
song, có cấu trúc chung. Hai mảnh  ở phía trong tạo thành một dải  kéo dài ra
tận phía 2 mảnh  ở phía ngoài. Tấm 3 có 3 mảnh  và 1 chuỗi xoắn  có chức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2. Vùng 2 là vùng không bền vững của
độc tố [20].
Vùng 3: chứa những tấm  dạng bánh kẹp Sandwich. Vùng này chứa đầu
nhóm carboxyl và có cấu trúc bền vững [8].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac
1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng
Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B. thuringiensis liên quan tới
sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Khi sâu ăn phải protein tinh
thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm
(pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối
lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa. Độc tố đã hoạt hóa bám
vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu.

2003, Phan Đình Pháp và CS đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua
phương pháp sử dụng súng bắn gene, đến năm 2005, gene kháng sâu trên được
chuyển vào cây cà tím thông qua Agrobacterium [12].
Những nghiên cứu trên đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong
việc ứng dụng các gene quý của Bt để tạo ra các cây trồng mới kháng được sâu
bệnh cũng như sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt.
1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể độc,
đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả của quá
trình lên men sản xuất chế phẩm Bt. Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng
các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều ảnh hưởng
tới quá trình sinh tổng hợp độc tố.
Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20-
40
0
C. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28- 32
0
C. Nếu nhiệt độ
dưới 20
0
C và trên 32
0
C đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào tử. Nếu
nuôi cấy ở 20
0
C thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy ở 35
0
C thì
thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ và số bào tử tăng lên.
Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 40

4
)
2
SO
4
không có hiệu quả
trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt. Trong khi đó các nguồn nitơ
hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình sinh
trưởng. Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau. Các nghiên cứu
cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt và các protein
tinh thể độc. Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng được coi là nguồn
dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt.
Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức
chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho
thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi. Ngoài ra, nếu bổ sung riêng rẽ
threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự hình
thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì sự ức
chế bị mất. Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu như có
mặt axit amin methionine. Acid  – picoline và acid flucoacetate cũng ức chế
việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc. Chất kháng sinh erythromycine
ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể
độc [8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.11. Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai
Gene cry1C
Gene cry1C có kích thước khoảng 3 kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc
tố có kích thước 288bp. Gene cry1C mã hóa protein tinh thể độc tố có khối
lượng phân tử khoảng 130kDa. Nhóm dưới loài B.thuringiensis subsp. aizawai