B GIÁO DC VÀ ÀO TO
IăHCăTHỄIăNGUYểN HOẨNGăTHăTHUăYN
NGHIểNăCUăCăIMăCUăTRÚCă
MTăSăGENăTHUCăHăMINăDCHăTỌMăSÚă
(PENAEUS MONODON)
LUNăỄNăTINăSăSINHăHC


3. Ni dung nghiên cu 2
Chng 1. TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1. Tôm sú và các bnh thng gp  tôm sú 3
1.1.1. Gii thiu v tôm sú 3
1.1.2. Tình hình nuôi va di ch bê nh tôm sú  Viê t Nam 5
1.1.3. Các bnh thng gp  tôm sú 7
1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh  tôm sú 12
1.2. H min dch tôm sú 14
1.2.1. áp ng min dch t bào 15
1.2.2. áp ng min dch dch th 21
1.3. Nghiên c u gen va tiê m nng  ng du ng trong pho ng tri bê nh cho tôm su 23
1.3.1. Tình hình nghiên cu genome tôm sú trên th gii 23
1.3.2. Nghiên cu gen liên quan đê n kha nng miê n di ch  tôm su 24
1.3.3. Tiê m nng ng du ng cu a gen liên quan đê n miê n dich trong pho ng
tr bnh  tôm su 28
Chng 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP 32
2.1. Vt liu 32
2.1.1. Thu thp mu 32 iv
2.1.2. Hóa cht 32
2.1.3. Thit b 34
2.1.4. Các vi sinh vt đc s dng trong nghiên cu 34
2.2. Phng pháp nghiên cu 35
2.2.1. Tách chit RNA tng s 36
2.2.2. Tinh sch mRNA 37
2.2.3. Tng hp cDNA 38
2.2.4. Thit k mi phân lp mt s gen (cDNA) la chn 41
2.2.5. Khuch đi gen bng phn ng PCR 48

3.6.1. Protein kha ng virus PmAV 90
3.6.2. Peptide kha ng khuâ n t ng t crustin (crustin - like antimicrobial
peptide) 94
3.6.3. Yê u tô kha ng khuâ n (ALF - antiliposaccharide factor) 99
3.7. Biê u hiê n yê u tô kha ng khuâ n tái t hp (rALFPm3) 105
3.7.1. To cu trúc vector biu hin gen 105
3.7.2. Xác đnh cu trúc gen ALFPm3 đc chuyn vào genome nm men 108
3.7.3. Xác đnh đon peptide ALFPm3 đc biu hin 109
3.7.4. Phân tích hot tính ca rALFPm3 111
KT LUN VÀ KIN NGH 113
1. Kt lun 113
2. Kin ngh 114
CỄCăCỌNGăTRỊNHăẩăCỌNGăB LIểNăQUANăN LUN ÁN 115
TÀI LIU THAM KHO
PH LC vi
DANHăMCăCỄCăKụăHIUăVẨăCỄCăCHăVITăTT
Tăvitătt
NghaătingăVit
NghaătingăAnh
5‟UTR
Vùng 5‟ không dch mã
5‟ Untranslated region
3‟UTR
Vùng 3‟ không dch mã
3‟ Untranslated region
AAP
Mi neo

DNA bô sung
Complement DNA
DP
Mi suy din
Degenerate primer
DNA
Axit deoxyribonucelic
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Hn hp các nucleotide (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP)
Deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTPs
Hn hp các deoxynicleotide
(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
Dideoxyribonucleoside triphosphate
dsRNA
RNA si kép
Double stranded RNA
DEPC
Cht kh Rnase
Diethyl pyrocarbonate
E. aerogenes
Vi khun Enterobacter aerogenes
Enterobacter aerogenes
E. coli
Vi khun Escherichia coli
Escherichia coli
EDTA
Axit ethylenediaminetetraacetic

Polymerase chain reaction
PmAV
Gen kha ng virus  tôm su
Penaeus monodon antivrus
PmRab7
Rab7  tôm sú
Penaeus monodon Rab7
P. pastoris
Nm men Pichia pastoris
Pichia pastoris
3‟RACE
Khuch đi nhanh đu 3‟ cDNA
Rapid amplification of cDNA 3' ends
5‟RACE
Khuch đi nhanh đu 5‟ cDNA
Rapid amplification of cDNA 5' ends
rALFPm3
ALF tái t hp  tôm sú dng 3 t
tôm sú
Recombinant anti-lipopolisaccharide
factor Penaeus monodon 3
RNA
Axit ribonucleic
Ribonucleic acid
RNAi
RNA can thip
RNA interference
RNase
Enzyme phân hy RNA
Ribonuclease

YHV
Virus gây bnh đu vàng
Yellow head virus
YP
Môi trng YP
Yeast peptone
YPD
Môi trng YPD
Yeast peptone dextrose viii
DANHăMCăCỄCăBNG Bng 1.1. Thô ng kê ca c gen liên quan đê n hê miê n dich  tôm 26
Bng 2.1. Các thit b s dng trong nghiên cu 34
Bng 2.2. Trình t các mi s dng trong nghiên cu 47

ix
DANHăMCăCỄCăHỊNH

Hình 1.1. Hình nh tôm sú 3
Hình 1.2. Tôm sú nhim WSSV 10
Hình 1.3. Tôm sú nhim YHV 12
Hình 1.4. Tê ba o ma u tôm su 17
Hình 1.5. H thng hot hóa proPO và tng hp melanin 19

Hình 3.13. Trình t gen và amino acid suy din ca hemocyanin 73
Hình 3.14. So sánh trình t amino acid ca protein hemocyanin gia các loài 75
Hình 3.15. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng mt phn đon
gen Ran 77
Hình 3.16. Trình t nucleotide và amino acid đon gen Ran 78
Hình 3.17. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 3‟-Ran 79
Hình 3.18. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 5‟-Ran 80
Hình 3.19. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca gen Ran 81
Hình 3.20. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Ran 82
Hình 3.21. So sánh trình t amino acid ca protein Ran gia các loài khác nhau 83
Hình 3.22. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen caspase 86
Hình 3.23. Trình t nucleotide và amino acid ca caspase 87
Hình 3.24. So sánh trình t nucleotide ca gen caspase ca tôm sú Vit Nam

vi trình t đã công b 88
Hình 3.25. So sánh trình t amino acid suy din ca protein caspase tôm sú
vi các loài tôm khác nhau 90
Hình 3.26. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen PmAV 92
Hình 3.27. Trình t gen và amino acid suy din ca protein PmAV 93
Hình 3.28. So sánh trình t amino acid ca protein PmAV 94
Hình 3.29. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen mã hóa
peptide kha ng khuâ n tng t crustin 96
Hình 3.30. Trình t gen và amino acid suy din ca gen mã hóa peptide
kháng khun tng t crustin 96 xi
Hình 3.31. So sánh trình t amino acid ca peptide kha ng khuâ n t ng t
crustin  tôm 98
Hình 3.32. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen ALF 100

chính phi k đn là vi khun và virus. Hin nay, các nghiên cu cho thy vic gim
sút sn lng tôm nuôi liên quan đn bnh vi khun thng do các vi khun
thuc chi Vibrio spp. Trong đó, loài gây bnh ph bin nht là vi khun phát sáng
V. harvey. Các tác nhân gây bnh do virus bao gm virus gây bnh đu vàng
(Yellow head virus - YHV), virus gây bnh đm trng (White spot syndrome virus -
WSSV)… đc xem là các tác nhân gây bnh nghiêm trng nht và làm thit hi
đáng k đn ngh nuôi tôm.
Cho đn nay, nhng hiu bit c bn v s điu khin sinh trng, sinh sn và
đc bit là h thng min dch  tôm sú còn rt hn ch do thiu nhng thông tin v
genome và s biu hin gen ca chúng. Kích thc genome tôm sú là rt ln (khong
trên 2 t cp base = 2/3 b gen ngi), nên vic gii mã toàn b genome tôm sú đòi
hi nhiu thi gian và chi phí ln, c tính hàng chc triu đô la. Vì vy, mt trong
nhng hng nghiên cu đ c l a cho n là lp bn đ di truyn liên kt genome tôm
sú, lp bn đ di truyn t DNA v tinh, phân tích trình t đy đ genome ty th
(mtDNA), lp bn đ gen tôm sú bng gii mã EST/cDNA, nghiên cu và phân tích
các đon trình t gen biu hin (Express sequence tag - EST), la chn các ch th
phân t phc v công tác chn ging, nghiên cu cu trúc và chc nng ca các gen
liên quan.
Tôm sú không có h thng đáp ng min dch thích ng thc s (adaptive
immune system), thay vào đó chúng phát trin h thng bo v c th khác đc gi
là min dch t nhiên (innate immunity). Nhng nghiên cu v phn ng t bào và
dch th  tôm khi b nhim vi khun, virus đã đc các nhà khoa hc rt quan tâm,
đc bit là xác đnh và phân tích đc đim ca các gen tham gia vào quá trình đáp
ng min dch. Vic phát trin và ng dng rng rãi Công ngh sinh hc trong lnh
vc thy sn đa đóng vai trò quan trng trong gii thích các quá trình phát sinh 2
mm bnh, phát trin các phng thc chn đoán và phòng nga, nhm duy trì s
n đnh ca ngh nuôi tôm, kim soát hu qu dch bnh, hn ch thit hi do dch


3
Chng 1.ăTNGăQUANăTẨIăLIU
1.1. TỌMăSÚăVẨăCỄCăBNHăTHNGăGPăăTỌMăSÚ
1.1.1.ăGiiăthiuăvătômăsú
Tôm sú có tên khoa hc là Penaeus monodon do Fabricius mô t và đt tên
nm 1798. Ngoài ra, loài tôm này còn đc gi vi tên đa phng là tôm rong [11].
Tôm sú là mt trong s các loài tôm nuôi quan trng thuc h Penaeidae và đc
phân loi nh sau [38].
Gii: Animalia
Ngành: Arthropoda
Ngành ph: Crustatacea
Lp: Malacostraca
B: Decapoda
B ph: Natantia
Siêu h: Penaeoidea
H: Penaeidae
Chi: Penaeus
Loài: monodon
C th tôm sú có màu xanh đm, có nhng vân sc t trng đen  các đt
bng. Phn còn li ca thân bin đi t màu nâu sang màu xanh hoc đ (Hình 1.1).
Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thc ln (có th lên đn 330 mm
hoc ln hn v chiu dài c th) và là loài tôm thng mi quan trng [209].

Hình 1.1. Hình nh tôm sú [14] 4
Tôm sú có ngun gc t n  Dng, phía Tây Nam Thái Bình Dng và
đc nuôi ch yu  các nc châu Á [174]. Loài tôm này sng  ni cht đáy bùn

[11], [145], [174].
Tht tôm sú là mt loi thc phm thy sn rt có li cho sc khe con ngi
và đc a thích trên th gii cng nh  Vit Nam. Thc phm t tôm rt tt cho 5
sc khe do cha các protein nng lng thp, ít cht béo, có hàm lng selenium,
amino acid cao, ngoài ra còn là ngun cung cp các vitamin cho con ngi. Nhiu
vitamin  tôm rt cn thit cho làn da khe mnh, xng và rng nh B6, E, A, D
và B12 Hàm lng vitamin B12, axit béo omega-3 cao  tôm rt có li cho tim
mch, ngn chn s tc nghn mch máu và bo v chng li bnh Alzheimer. Các
nghiên cu trc đây cho rng: thc phm t tôm có cha cholesterol do đó nh
hng đn tim mch. Tuy nhiên, khi so sánh vi các thc phm khác nh trng thì
tôm có hàm lng cholesterol thp hn. Do đó, n tôm có th chng li bnh ri
lon nhp tim và huyt áp cao. Hàm lng các mui khoáng cao, đc bit là
selenium  tôm có vai trò cm ng tng hp và sa cha DNA, loi b các t bào
bt thng, c ch s sinh sn t bào ung th và gây nên s cht theo chng trình
(apoptosis) ca t bào. Ngoài ra, selenium còn tham gia vào các v trí hot đng ca
nhiu protein quan trng, bao gm c các enzyme chng oxy hóa [143], [231].
Tôm sú là loài đng vt thy sn đc khai thác t nhiên cng nh nuôi,
mang li li nhun rt ln nh xut khu ti nhiu nc trên th gii, trong đó có
các nc châu Á nh Thái Lan, Vit Nam, Hàn Quc, ài Loan, Malaysia,
Indonesia, n  [174]. Ngh nuôi tôm sú có u th rt ln đi vi các nc này
vì đây là ngun tài nguyên bn đa có th nuôi và khai thác lâu dài, có đóng góp ht
sc quan trng vào vn đ an toàn lng thc, xoá đói gim nghèo và phát trin
kinh t xã hi ca mi nc. Theo Hip hi Ch bin và Xut khu thy sn Vit
Nam (VASEP), nm 2010, din tích nuôi tôm sú c nc đt 613.718 ha, giá tr
xut khu tôm sú đt 1,45 t USD [16].
1.1.2. Tình hình nuôiăva ădi chăbê nhătôm sú ăVităNam
Nc ta có din tích mt nc ngt, l và bin khá ln, bao gm các sông,

ging và kim soát dch bnh. Các nghiên cu bc đu tp trung nghiên cu đa
dng genome tôm sú [9], phát hin bnh tôm sú [3], [4], [13], đa ra gii pháp
phòng bnh cho tôm sú [2], nghiên cu mt vài protein cu trúc tái t hp ca
WSSV trong phòng thí nghim nhm mc đích phòng tr bnh cho tôm sú [1], [12],
[15]. ây là nhng hng nghiên cu phù hp và có trin vng, đt c s khoa hc,
k thut cho phép thc hin các nghiên cu nâng cao cht lng ca ging thy sn
có giá tr kinh t cao này. 7
1.1.3. Các bnhăthngăgpăătômăsú
1.1.3.1. Bnh do vi khun
Các vi khun liên quan đn bnh  tôm có th là ngun bnh trc tip hoc
gây bnh c hi. Bnh truyn nhim do vi khun  tôm có th gây cht, tn thng
kitin, hoi t, s đi màu ca mang, tng trng chm, lp biu bì lng lo, rut
trng, trng thái hôn mê và hp th thc n gim… Các vi khun gây bnh ch yu
 tôm nuôi là Vibrio, vi khun dng si, vi khun màng nhày, vi khun phân hy
chitin và vi khun kỦ sinh [103].
Các loài vi khun thuc chi Vibrio spp là ngun gây bnh chính  tôm, chúng
phân b rng rãi trong môi trng nc ngt, nc l và bin. Hn 20 loài thuc chi
này đã đc bit đn, mt s trong chúng là ngun bnh  ngi (V. cholerae, V.
parahaemolyticus và V. vulnificus) trong khi mt s loài là ngun bnh ca các đng
vt  nc bao gm tôm (V .harveyi, V. spendidus, V. penaecida, V. anguillarum, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus). Phn ln các loài trong chi Vibrio spp đc cho là
ngun bnh c hi, mt s trong chúng có th là ngun bnh chính nh V. harveyi. V.
harvey là vi khun phát sáng đc tìm thy trên b mt c th và rut ca các sinh vt
sng  nc bin, nc l và cng tìm thy trong các ao nuôi tôm và đáy ao [95],
[189]. Tác nhân gây bnh hoi t gan ty là do Proteobacterium alpha. Các vi khun
si nh Leucothrix mucor, Thiothrix sp, Flexibacter sp, Flavobacterium, Cytophaga
sp có th gây bnh cho tôm  giai đon u trùng. Du hiu ca bnh là màu mang

đon u trùng và u niên. Các kỦ sinh trùng này đi vào c th tôm qua vt thng
và xâm nhim vào máu, mang làm tng t l cht, đc bit trong trng hp có s
xâm nhim kt hp vi các kỦ sinh trùng khác nh Leptonmonas spp. Tôm b nhim
các kỦ sinh trùng này có th chn đoán bng kim tra đ đc ca máu, máu không
đông, lng t bào máu gim và s lng kỦ sinh trùng tng rt ln. Các đng vt
nguyên sinh kí sinh bên trong tôm thng tn ti di dng nhóm, chúng có 2 loi
vt ch là đng vt thân mm (giun đt) và giáp xác. Các nhóm đng vt nguyên
sinh đc phát hin  tôm bao gm: Nematopsis litopenaeus, Paraphioidina
scolecoide, Caphalobolus litopenaeus, Caphalobolus petiti và Caphalobolus stenai.
Các bào t trng thành và giao t đc tìm thy  thành rut và các khoang ca c 9
th. Các bnh do kỦ sinh trùng gây gim hp th thc n nhng dng nh ít nh
hng đn nuôi trng thy sn. Mt s kỦ sinh trùng khác nh Agmasoma spp,
Microsporidium spp có th xâm nhim vào c, tim, tuyn sinh dc, mang và gan
ty. Tôm b nhim dn đn các mô b m đc và un cong c th nhng không gây
cht tôm, tôm b bnh nh hng đn cht lng sn phm. Có th chn đoán bnh
này nh quan sát các bào t  mô c b nhim [103].
1.1.3.3. Bnh do virus
Virus là ngun bnh ph bin nht  bin, chúng hin din đn 10 t trong 1
lít nc bin và mt s trong chúng có th nhim vào nhiu sinh vt [74]. n nay,
các nhà khoa hc đã phát hin hn 20 loi virus nhim  tôm [126]. Trong s các
virus này, virus đc nghiên cu nhiu nht  tôm nuôi là WSSV, YHV và TSV,
chúng đc cho là các virus gây bnh nghiêm trng nht  tôm [59]. Tuy nhiên, có
rt ít hiu bit v các virus này  giáp xác hoang dã [34]. Trong đo , tôm su nhim
WSSV và YHV gây nên bnh nghiêm trng cho tôm nuôi, kt qu dn đn s thit
hi ln v kinh t.
Bnh đm trng gây ra bi virus gây hi chng đm trng (White spot
syndrome virus - WSSV) đc phát hin ln đu tiên  ài Loan nm 1992, tip

WSSV có th đc truyn nhim theo c chiu ngang và chiu dc [66]. S
lây truyn này có th qua nc và thc n, các loi giáp xác hoang dã trong ao và do
tôm kho n con b nhim bnh đm trng [50], [100]. Các mô đông lnh cng có th
là nguyên nhân lây truyn bnh [63]. Sau đó s xâm nhim đc cho là ch yu
thông qua mang, nhng có th xy ra thông qua b mt khác ca c th [42], [50],
[51]. WSSV cng lây truyn theo chiu dc trc tip t m sang con cái, duy trì qua 11
giai đon u trùng, tôm ging và đã đc chng minh bng thc nghim mc dù s
xut hin ca WSSV  trng ca tôm vn cha đc rõ ràng [122], [158]. Kt qu
theo dõi tôm sú nuôi ti Vit Nam ca Bùi Quang T cho thy WSSV lan truyn theo
chiu ngang là chính [8]. Cho đn nay, không có loài tôm nào thuc h tôm he đc
bit là có kh nng kháng WSSV [117], [127]. Có nhiu phng pháp đ chn đoán
WSSV bao gm phng pháp mô hc và kính hin vi đc thc hin bng cách kim
tra phn mô nhum màu [117]; các phng pháp min dch da trên vic to ra
kháng th đn dòng và đa dòng đ chng li các kháng nguyên virus. Các kháng th
đn dòng và đa dòng [135], [242], phân tích min dch [147]. Bên cnh đó, các
phng pháp sinh hc phân t đc s dng ph bin nh phng pháp Dot blot
[62], [182], k thut lai phân t [42], [230], phng pháp PCR [117], [121].
Bê nh đâ u va ng gây ra do virus gây hô i ch ng đâ u va ng (Yellow head virus –
YHV) đc phát hin lâ n đu tiên  tôm sú ti Thái Lan nm 1990. Tôm nhim
YHV thng đc mô t vi màu vàng sáng  vùng đu ngc và c th thng
nht nht (Hình 1.3). Màu vàng ca vùng đu ngc là do triu trng bnh  gan ty
màu vàng [44]. YHV lan rng và nhanh trong các vùng nuôi tôm sú  Thái Lan.
Tôm b nhim YHV cht trong vòng vài gi và toàn b tôm nuôi có th b thit hi
trong vòng 3-5 ngày sau khi xut hin tôm nhim [72] vi s hoi t  c quan bch
huyt, mang, mô liên kt, t bào máu và c quan to máu [216]. C quan bch huyt
có th là đích đu tiên ca YHV da trên c s nghiên cu mô bnh và nghiên cu
th th YHV [24], [130]. Ngoài tôm sú, YHV gây bnh  tôm th chân trng
13
thin môi trng nuôi bng cách thng xuyên s dng các loi vôi mt cách hp
lỦ, s dng máy qut nc đ gom t các cht thi vào gia ao. Vic tng cng s
dng các loi ch phm sinh hc, b sung đng carbon xung ao to điu kin cho
vi khun có li phát trin mnh át ch vi khun gây bnh. Ngoài ra, cn tng cng
sc kho ca tôm bng cách b sung vitamin C vào thành phn thc n. Các vi
khun có li cng đc các nhà khoa hc nghiên cu ch bin trong thc n tôm có
tên gi là probiotics. Khi tôm b nhim bnh có th s dng các loi thuc kháng
sinh nh Furacin, Oxytetracycin… trn vào thc n cho n liên tc 7-10 ngày [8].
Phng pháp này có hn ch là chi phí mua thuc ln, d lng kháng sinh ln 
c th tôm nh hng đn môi trng, sc khe con ngi và xut hin các mm
bnh kháng thuc có th là ngun bnh lây nhim cho con ngi. Vì vy, cn phi
tìm ra mt cht mi có th thay th cho thuc kháng sinh đng thi chng li mm
bnh trên thy sn [238].
i vi các bnh do nm và kỦ sinh trùng cn phi s dng gii pháp phòng
và tr bnh tng hp. Trong các ao tri m ging, nuôi tôm, thc n ti sng có
nguy c nhim ngun bnh do vy cn phi đc kh trùng. áy ao phi thng
xuyên đc x lỦ bng các hóa cht đ dit ngun bnh trong phân trc khi nuôi.
Mt s hóa cht đã đc s dng nh formalin, xanh malachite và trelafan [8].
Hin nay, cha có phng pháp hiu qu đ x lỦ các bnh do virus gây ra.
Do vy, chin lc chính đ gim bnh  tôm là phòng tránh.  phòng bnh tôm
sú trc tiên phi kim nghim và chn con ging sch bnh trc khi th nuôi
bng các phng pháp khác nhau, trong đó PCR là phng pháp tng đi hiu
qu. Thêm vào đó ao nuôi tôm cn đc tháo cn nc và x lỦ bng hóa cht,
nc đc đa vào ao nuôi cng phi đc x lỦ bi các hóa cht cho phép đ loi
b các tác nhân có th gây bnh. Tip theo, ngi nuôi tôm phi chn mùa v thích
hp đ th tôm, tránh th tôm vào gia và cui mùa ma do nhit đ không khí và
lng nc thp. Ma ln có th là mt nguyên nhân đa nc cha đc x lỦ vào