BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH
CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE
TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH
CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE
TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 07
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. CAO HỮU NGHĨA

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014



Phạm Thị Hoài An


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình - sơ đồ - biểu đồ
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4
1.1. Klebsiella pneumoniae .............................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm vi sinh học ......................................................................................4
1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc ................................................................................4
1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên .............................................................................4
1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen.........................................................................................5
1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy ....................................................................................5
1.1.1.5. Tính chất hóa sinh ....................................................................................6
1.1.2. Khả năng gây bệnh .........................................................................................6
1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh .......................................................................................6
1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng...................................................................................6
1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật .....................................................................................6
1.1.4. Phòng bệnh và điều trị ....................................................................................6
1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................7
1.2.1. Định nghĩa kháng sinh ....................................................................................7
1.2.2. Phân loại kháng sinh .......................................................................................7
1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng ......................................................................7

2.1.1. Đối tượng ......................................................................................................32
2.1.2. Cỡ mẫu .........................................................................................................32
2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................................32
2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài ..............................................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................33
2.2.1. Vật liệu..........................................................................................................33
2.2.2. Phương pháp thực hiện .................................................................................36


2.2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu
...............................................................................................................39
2.2.2.2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm ...........................................42
2.2.2.3. Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae ...43
2.2.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer .............................47
2.2.2.5. Thử nghiệm đĩa đôi ................................................................................50
2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test ...........................................................................51
2.2.2.7. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ..............................52
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................57
3.1. Đặc tính mẫu...........................................................................................................57
3.1.1. Đặc tính về giới tính của bệnh nhân .............................................................57
3.1.2. Đặc tính về tuổi bệnh nhân ...........................................................................57
3.2. Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm................58
3.3. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae ...........................59
3.4. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng........................................63
3.5. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase ..................................................67
3.6. Kết quả PCR ...........................................................................................................68
3.6.1. Gen CMY-2 ..................................................................................................69
3.6.2. Gen bla OXA -1 .................................................................................................72
3.6.3. Gen bla NDM-1 .................................................................................................75
3.6.4. Gen bla IMP .....................................................................................................78


CDC

Centers for Disease Control and Prevention - Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kì

CFU

Colony Forming Unit - Đơn vị tạo khuẩn lạc

CIP

Ciprofloxacine

CN

Cephalexine

CLSI

Clinical and Laboratory Standard Institute - Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và
Xét nghiệm

CS

Colistin

CO

Columbia Agar + 5% máu cừu


International Organization for Standardiazation - Tổ chức tiêu chuẩn hóa
quốc tế

IPM

Imipenem

KPC

Klebsiella pneumoniae Carbapenemase

LPS

Lipopolysaccharide

MHA

Mueller Hinton Agar


MBL

Metallo- β -lactamase

MPM

Meropenem

MEC


SXT

Trimethoprim+Sulfamethoxazole

TE

Tetracyline

TSA

Tryptic Soy Agar

UDP

Uridindiphosphat

WHO

World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam……………………………………....9
Bảng 1.2. Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler…………………………....18
Bảng 1.3. Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush………………………......18
Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm……………………………....39
Bảng 2.2. Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh………......53
Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR…………………………………........54

Hình 2.5. Thử nghiệm đĩa đôi………………………………………………………...51
Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test……………………………………………….........52
Hình 3.1. Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….69
Hình 3.2. Kết quả PCR gen bla OXA-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….72
Hình 3.3. Kết quả PCR gen bla NDM-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…....76
Hình 3.4. Kết quả PCR gen bla IMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 –
Mỹ)….......79

Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae………37
Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy Klebsiella pneumoniae từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu,
dịch não tủy, nước tiểu………………………………………………………………..38
Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy
khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch………………………………………………...48

Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae………………….61
Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng………………..63


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Klebsiella là một loại vi khuẩn Gram âm thường được tìm thấy trong ruột của
người (mà không gây bệnh), phân người hoặc ở đường hô hấp. Chúng xâm nhập vào
đường hô hấp (hít thở) và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi,
hoặc xâm nhập vào đường máu gây nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng vết thương,
nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang...
Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc
kháng sinh carbapenem, điển hình là ổ dịch hoành hành khắp các bệnh viện ở Israel
khiến 120-200 người tử vong bắt đầu khoảng năm 2006 [65], cùng thời điểm đó tại các

pneumoniae tại viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh”
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định đặc tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại Viện Pasteur
Tp. Hồ Chí Minh.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ các bệnh phẩm tại Viện
Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ 01-06/2014.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nuôi cấy, phân lập và định danh chủng Klebsiella pneumoniae.
- Khảo sát tỷ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae ở giới tính, các lứa tuổi, bệnh
phẩm khác nhau.
- Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae phân lập được.
- Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi,
sinh carbapenemase bằng Hodge test.
- Xác định một số gen mã hóa cho tính kháng kháng sinh của Klebsiella
pneumoniae.
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng
lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, β-lactamases phổ
rộng, phát hiện gen kháng thuốc được thực hiện theo quy trình chuẩn của Viện Pasteur
Tp. HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007.
- Thu mẫu bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu.
- Phân lập và định danh các chủng Klebsiella pneumoniae bằng các thử nghiệm
hóa sinh hoặc API 20E.


3

- Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer.
- Thử nghiệm đĩa đôi, thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella

đậm ở hai cực, kích thước 0,5-2 µm, hình que, không có lông, không di động, có vỏ,
không sinh nha bào [75] [85].
1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên
Gồm hai loại kháng nguyên trên bề mặt tế bào
+ Kháng nguyên O
Đây là kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O bản chất là
lipopolysaccharide (LPS) một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm
cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên,
còn lipid quyết định các đặc tính sinh học và độc tính (nội độc tố). Kháng nguyên O
bao gồm 20 đến 40 đơn vị oligosaccharide, mỗi đơn vị oligosaccharide lại bao gồm 2
đến 8 monosaccharid khác nhau. Dựa trên sự có mặt hay thiếu hụt của kháng nguyên
O mà khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ biểu hiện là dạng S (dạng S - Smooth: nhẵn, khuẩn lạc


5

thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng) hoặc R (dạng R - Rough: xù xì, khuẩn
lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô) khi vi khuẩn được nuôi cấy
trên đĩa thạch Agar. Kháng nguyên O không bị huỷ ở 100°C trong hai giờ hoặc trong
cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Người ta đã
biết có 9 serotypes khác nhau của Klebsiella pneumoniae. Kháng nguyên O có tính đặc
hiệu cao và thường được sử dụng để phân loại vi khuẩn.
+ Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, mang
tính chất đặc hiệu type với hơn 80 serotypes khác nhau. Trong đó type 1 và type 2 hay
gặp nhất trong nhiễm khuẩn đường hô hấp.
Cả hai góp phần vào khả năng gây bệnh và cơ sở hình thành serogrouping [4][6]
[72] [76].
1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen
Bộ gen hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 2006 tại trung tâm giải trình tự gen
tại Đại học Washington ở St Louis. Bộ gen được đặt tên là Klebsiella pneumoniae

giảm miễm dịch hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp (đang dùng máy hô hấp
nhân tạo), gây nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản thứ
phát, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu, đường mật, đường sinh dục, viêm
màng não, viêm xoang, viêm nội tâm mạc [4] [6].
1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật
Chủ yếu dựa vào chẩn đoán trực tiếp từ các bệnh phẩm khác nhau: đàm, mủ,
máu, dịch não tủy... bằng cách nuôi cấy lên các môi trường thích hợp để phân lập và
xác định vi khuẩn dựa vào hình thể, tính chất nuôi cấy đặc biệt (khuẩn lạc nhầy, dính),
tính chất sinh hóa, khả năng gây bệnh. Xác định type bằng phản ứng ngưng kết hoặc
phản ứng phình vỏ với kháng huyết thanh đặc hiệu type [4] [6].
1.1.4. Phòng bệnh và điều trị
+ Phòng bệnh
Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Thực hiện các biện pháp
phòng bệnh chung. Chủ yếu là tránh những điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng cơ hội
xuất hiện bằng cách nâng cao sức đề kháng của người bệnh và dự phòng tốt các nhiễm
trùng bệnh viện [4] [6].


7

+ Điều trị
Sử dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên Klebsiella pneumoniae
thường có sức đề kháng cao với kháng sinh. Nên cần cẩn thận, cân nhắc để lựa chọn
kháng sinh công hiệu [4] [6].
1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh
1.2.1. Định nghĩa kháng sinh
- Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming người Scotland lần đầu tiên thấy
trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicilium thì khuẩn lạc gần
nấm này sẽ không phát triển được, sau đó chất peniciline đã được chiết xuất từ nấm để
dùng trong điều trị.

Sulfamid,

Diaminopyrimidin:

Trimethoprim,

Diaveridin,

Ormethoprim,

Pyrimethamin
1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng
Tùy thuộc vào phạm vi của các loại vi khuẩn mà nó ảnh hưởng người ta chia:
kháng sinh đặc hiệu, kháng sinh phổ rộng, kháng sinh phổ hẹp.
 Kháng sinh đặc hiệu là các loại kháng sinh có khả năng tác động lên một loại vi
khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định (Spectinomycin tác động lên vi khuẩn lậu).
 Các loại kháng sinh phổ rộng có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác
nhau, được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh truyền nhiễm. Nhóm này gồm:
Amoxicillin;

Carbapenems:

Imipenem,

Meropenem,

Ertapenem;

Piperacillin/tazobactam; Levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Ciprofloxacin;
Streptomycin; Tetracycline; Chloramphenicol; Ticarcillin...

Penicillins

Kháng sinh tiêu biểu

Penicillin

Penicillin

Amino- penicillin

Ampicillin, Amoxicillin

Ureido- penicillin

Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin

Carboxy- penicillin

Carpenicillin, Ticarcillin


10

Penicillinase-stable

Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin,

penicillins

Nafcillin, Oxacillin


cefonicid, caforanid, cefamandol,
cefprozil, cefoxitin, cefmetazol…
cefotaxim, cefixim, cefoperazon,

Cephalosporin thế hệ III

Cephalosporin thế hệ IV

Cephalosporins kháng
sự hoạt động của MRSA

ceftazidim, ceftizoxim, ceftriaxon…

cefepim, cefpirom

Ceftaronline, Ceftopiprole

Cephamycin

Cefmetazole, Cefotetan, Cefoxitin

Oxacepem

Moxalactam
Cefaclor, Cefadroxil, Cefdinir,

Cephems
(uống)


Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin
Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin,…
Nhóm co-trimoxazol: co trimoxazol.
Nhóm peptid: glucopeptid: vancomycin, polypeptid: polymyxin, bacitracin.
1.2.2.5. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh
- Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn: bao gồm các
kháng sinh như: bacitracin, cephalosporin, cycloserine, penicillin, rostocetin,
vancomycin.
- Ức chế chức năng của màng tế bào: các nhóm kháng sinh gồm có colistin,
polymyxin, gentamicin...
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: là những kháng sinh như:
chloramphenical, erythromycins, lincomycins, tetracylines, aminoglycoside,...
- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bao gồm có actinomycin, mitomycin,
nalidixic acid, novobiocin, pyrimethamine, rifampin, sulfonamides, trimethoprim.
- Thuốc ức chế chuyển hoá: cotrimoxazole.
1.3. Cơ chế tác động của kháng kháng sinh
Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng
bằng cách:


12

Hình 1.4. Cơ chế tác động của kháng sinh
1.3.1. Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn
Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế
bào có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở
bên trong tế bào. Vách chiếm 20% trọng lượng khô của tế bào vi khuẩn Gram dương
lớn hơn Gram âm từ 3 đến 5 lần. Dưới tác dụng của thuốc kháng sinh thì sự tổng hợp
vách tế bào bị ức chế. Các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có
vách (Protoplast) còn các vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh (spheroplast).

mRNA
- Tetracyclin làm ngăn cản sự gắn kết của tARN vào phức hợp ribosome mARN
- Streptomycin làm thay đổi hình dạng 30S mã hóa trên mARN nên đọc nhầm.
- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
- Aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá
trình dịch mã không chính xác.
Vi khuẩn có những ribosome 70S, còn tế bào nhân thực lại có ribosome 80S.
Những tiểu đơn vị của mỗi loại ribosome khác nhau về chức năng và thành phần hóa
học nên kháng sinh có thể ức chế sự tổng hợp protein ở ribosome của vi khuẩn mà
không có ảnh hưởng lớn lên ribosome của tế bào chủ [1] [10].
1.3.4. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic
Phần lớn những kháng sinh thuộc nhóm này ức chế hiệu quả sự tổng hợp ADN
của vi khuẩn, một số còn ngăn chặn việc tổng hợp ARN của vi khuẩn [1] [10].
- Actinomycin: ức chế hiệu quả sự tổng hợp ADN. Thuốc gắn vào ADN tạo nên


14

một phức hợp, các phức hợp này ức chế các ARN tương ứng đặc biệt là mARN.
Mitomycin gắn vào 2 chuỗi ADN ngăn cản chuỗi tách rời làm ADN không được chép.
Cả Actinomycin và Mitomycin đều ức chế vách tế bào vi khuẩn lẫn tế bào động vật
nên ít được dùng trong điều trị.
- Rifampin: Rifamin ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách gắn chặt vào
các ARN polymerase nên ngăn chặn sự tổng hợp ARN của vi khuẩn.
- Quinolon: các quinolon và cacboxyflouroquinolon kết hợp vào ADN gyrase, ức chế tác dụng của enzyme ADN-gyrase làm cho hai mạch đơn của
ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN.
- Các sulfonamide: đối với nhiều vi sinh vật, acid para-aminobenzoic (viết tắt là
PABA) là một chất chuyển hoá cần thiết trong quá trình tổng hợp acid folic cần thiết
để tổng hợp purin trong ADN. Sulfonamide do có cấu trúc tương tự PABA) có tác