BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
__________________________

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
_________________________

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THANH THỦY



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC

............................................................................................................. iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .............................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ ix
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................. ix
MỞ ĐẦU

...............................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Sơ lược về enzyme ...........................................................................................3
1.1.1 Khái niệm về enzyme ................................................................................3
1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme ..........................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme ....................................................................4
1.2. Protein và enzyme protease .............................................................................5
1.2.1. Protein.......................................................................................................5
1.2.1.1. Khái niệm ..........................................................................................5
1.2.1.2. Cấu trúc của protein .........................................................................5
1.2.1.3. Sự biến tính của protein ....................................................................6
1.2.2. Protease.....................................................................................................7
1.2.2.1. Khái niệm ..........................................................................................7
1.2.2.2. Phân loại ...........................................................................................7
1.2.2.3. Cơ chế tác dụng của protease .........................................................10

2.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram.............................................................32
2.3.3.3. Phương pháp nhuộm bào tử ............................................................32
2.3.3.4. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase. .............................33
2.3.4. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ...................33
2.3.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp mật độ quang.. ...................34
2.3.6. Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) ...........................................................35
2.3.7. Thu dịch enzyme thô ..............................................................................35
2.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính
thủy phân. . ......................................................................................................36


v

2.3.9. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. ...............37
2.3.10. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry .......................39
2.3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của các chủng VK .......................................................40
2.3.11.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy .........................................................40
2.3.11.2. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng ..................................................41
2.3.11.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ....................................41
2.3.11.4. Ảnh hưởng của pH môi trường. ....................................................41
2.3.11.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy. ................................................41
2.3.11.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc .............................................................41
2.3.11.7. Nghiên cứu động học của quá trình lên men ................................42
2.3.12. Tách và thu nhận chế phẩm protease [20], [28] ...................................42
2.3.13. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE
protease .............................................................................................................43
2.3.13.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ CPE protease ..............................43
2.3.13.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ CPE protease......................43
2.3.14. Phương pháp xác định đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ........43

3.6.2. Hoạt độ protease thu nhận bởi các tác nhân tủa của CPE ......................69
3.7. Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease thô ...........70
3.7.1. Ảnh hưởng của pH .................................................................................70
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .........................................................................71
3.8. Khảo sát sự thủy phân của các cơ chất protein khác nhau bởi chế phẩm
protease. ................................................................................................................73
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................78
4.1. Kết luận ..........................................................................................................78
4.2. Kiến nghị........................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80


vii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CPE

Chế phẩm enzyme

CPE B

Chế phẩm enzyme của chủng B. amyloliquefaciens CT3

DNS

Acid 3,5 - dinitrosalicylic

EDTA


NS

Nấm sợi

NT

Nitơ tổng

OD

Mật độ quang

PMSF

Phenylmetysulfonyfuoride

TB

Trung bình

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


viii

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt độ chung, hoạt độ riêng của
CPE B ............................................................................................................................. 69
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B ............................................... 70
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B ....................................... 72
Bảng 3.17. Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ
chất khác nhau ................................................................................................................ 74
Bảng 3.18. Hiệu suất thủy phân của CPE B theo thời gian trên các cơ chất khác
nhau ................................................................................................................................ 76


x

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Biểu đồ 3.1. Hoạt độ protease của một số chủng VK ...............................................50
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................54
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................56
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................58
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ......59
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ............61
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus .........63
Đồ thị 3.5. Động học quá trình lên men của chủng CT3 ..........................................65
Đồ thị 3.6. Động học quá trình lên men của chủng CT7 ..........................................65
Biểu đồ 3.4. Hiệu suất thu hồi của CPE B bởi các tác nhân tủa khác nhau ..............68
Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B ..........................................71
Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B ..................................72
Đồ thị 3.9. Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ
chất khác nhau ...........................................................................................................75

hemicellulase, glucanase, xylanase, protease,…
Ở Việt Nam ngành công nghiệp enzyme vẫn chưa thực sự phát triển, hàng
năm nước ta phải nhập một lượng lớn các enzyme để ứng dụng trong công, nông
nghiệp và giải quyết ô nhiễm MT. Cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu và sử
dụng prorease tập trung trên các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một số đặc
tính của enzyme, tuy nhiên vẫn còn hạn chế do giá thành chế phẩm enzyme còn cao.


2

Cần tiếp tục nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra giải pháp ứng
dụng phù hợp điều kiện sản xuất thực tế ở Việt Nam.
Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát
khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus.”
 Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp
protease cao.
 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng Bacillus phân lập từ các mẫu đất vườn khác
nhau ở phường Hiệp Bình Chánh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
 Nhiệm vụ của đề tài.
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh protease có hoạt độ cao
từ các mẫu đất vườn.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng
đã chọn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT đến hoạt độ protease của các
chủng. Chọn 1 chủng có hoạt độ protease cao để phân loại tới loài và thu nhận CPE
protease bán tinh khiết.
- Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố lý hóa lên hoạt tính của CPE protease.
- Bước đầu thử nghiệm tác dụng của CPE protease trong việc thủy phân các
cơ chất protein khác nhau: casein, bột cá và bột đậu nành.


giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphotphase khác.


4

1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme
Enzyme là những protein được cấu tạo bởi các L- α amino acid kết hợp với
nhau qua liên kết peptid (- CO – NH -).
Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là
enzyme một thành phần, hoặc là protein phức tạp, gọi là enzyme hai thành phần hay
holoenzyme.
Enzyme một thành phần thì chỉ được cấu tạo bởi một thành phần hóa học
duy nhất là protein, những enzyme này thường xúc tác cho phản ứng thủy phân.
Enzyme hai thành phần gồm có:
- Phần protein gọi là apoprotein hay apoenzyme.
- Phần phi protein gọi là cofactor (yếu tố phối hợp) có vai trò thúc đẩy quá
trình xúc tác. Các cofactor có thể là các ion kim loại (Cu2+, Zn2+, Fe2+…) [6].
Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme
kết hợp với cơ chất biến đổi cơ chất thành sản phẩm phản ứng. Có những enzyme
có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt
động [3]. Mỗi trung tâm hoạt động thường gồm 2 vùng:
- Vùng gắn với cơ chất: còn gọi là trung tâm tiếp xúc hay trung tâm cơ chất,
là vùng liên quan tới tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất.
- Vùng xúc tác: có nhiệm vụ tạo ra khả năng cần thiết nhằm biến đổi chuyển
hóa cơ chất đã được gắn vào enzyme, tạo điều kiện chuyển thành sản phẩm dễ dàng
hơn. Vùng xúc tác liên quan tới kiểu phản ứng.
1.1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các
đặc điểm của chất xúc tác nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau:
E + S  ES  P + E


Hình 1.1. Cấu trúc chung của acid amin


6

 Có 4 bậc cấu trúc của protein
 Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình
thành nên chuỗi polypeptide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin
thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một
của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide.
Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên
chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ
đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai
trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến
sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.
 Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong
không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu
trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hydro giữa những
acid amin ở gần nhau.
 Cấu trúc bậc ba: các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau
thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không
gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc
này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm –R trong các mạch polypeptide.
Chẳng hạn nhóm –R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S), nhóm – R của
prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp hay
những nhóm – R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì
chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay điện hóa
trị có ở giữa các nhóm –R có điện tích trái dấu.
 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với

 Dựa vào cơ chế xúc tác
Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm:


8

 Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầu
mạch. Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc
amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase.
 Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội
mạch. Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptidase
[39], [2], [3].

Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme protease
 Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [16], [53]
Dựa vào cấu trúc nhóm chức ở trung tâm hoạt động, endopeptidase được
chia thành 4 nhóm:
 Serin – proteinase (EC 3.4.21): là những protease có nhóm (-OH) của
serine trong trung tâm hoạt động ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
 Cystein – proteinase (EC 3.4.22): là các protein có nhóm thiol (-SH) của
acid amin cystein ở trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease
thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng. Các cyteine protease
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
 Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo protease (EC 3.4.23): metallo protease là nhóm protease trong
cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở VK, nấm sợi cũng như các VSV bậc cao hơn.


liên

kết

peptide,

do

đó

còn

được

gọi

là

carbonxyendopeptidase.
 Nhóm II - Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặc điểm có
cấu tạo của trung tâm hoạt động.
 Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino acid về
phía nhóm –NH - của liên kết peptide, do đó còn được gọi là aminoendopeptidase.
 Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồn gốc
amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide.


10

1.2.2.3. Cơ chế tác dụng của protease

11

Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong quả
[71]. Ví dụ: papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ, bromelain thu từ quả,
chồi dứa, vỏ dứa [38]. Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả [81], [12].
Ở VSV, nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease như VK, xạ khuẩn,
NS. Protease có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào MT nuôi cấy [7], [10].
Các VK thông thường dùng trong tổng hợp protease là B. subtilis, B. cereus,
B. brevis, B. licheniformis…sinh các protease trung tính. B. thermophilus tổng hợp
protease chịu nhiệt. Xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S. griseus, S.
rimosus…NS tổng hợp protease gồm có A. oryzae, A. awamori, A. niger, một số
loài Penicilium và Rhizopus [17], [22].
Trong ba nguồn sinh vật dùng để khai thác và thu nhận enzyme, nguồn VSV
được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì có các ưu điểm sau:
- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzyme từ VSV vì quá trình sinh
trưởng, phát triển và tổng hợp enzyme của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào
điều kiện ngoài.
- Chu kì sinh trưởng và phát triển của VSV ngắn do đó việc sản xuất enzyme
từ VSV trong thời gian ngắn từ 36h – 60h.
- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzyme từ VSV theo hướng sản
xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn.
- Giá thành của enzyme sản xuất từ VSV thấp. MT nuôi cấy VSV thường
đơn giản và rẻ tiền.
- Các enzyme thu được từ VSV có hoạt tính rất cao.
- VSV có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau.


12

Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm và nguồn gốc thu nhận các nhóm protease


18-35

pH tối ưu

3-5

2-3

5-7

6-11

nhiệt độ tối ưu

40-55

40-55

65-85

50-70

Ca2+

-

Ca2+, Zn2+

Ca2+

chế chính

Pestatin

Các tác nhân

EDTA, chất ức

Indoacetanide p-

bắt giữ như

chế trysin đậu

CMB

EDTA,

nành, indole,

EGTA

phenol, aid
triamino acetic

Aspergillus,
Mucor, Endothia,
Nguồn thu

Rhizopus,

Streptococcus,

Streptomyces

Clostridium


13

1.2.2.5. Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [1],
[3], [12].
 Công nghiệp thực phẩm
 Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng [12]. Tuy nhiên, protease VSV có nhược điểm
là chúng còn có khả năng thủy phân sâu casein làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng
phomat [57]. Ở Nhật Bản, từ canh trường bề mặt của Mucor, người ta thu được chế
phẩm protease dùng trong sản xuất phomat. Một số nước cũng thu được chế phẩm
tương tự từ nấm mốc A. candidus, hoặc từ B. mensentericus.
 Trong sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn bột,
giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp và nở tốt hơn.
 Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, protease được dùng làm mềm
thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ
mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân
từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, … [25].
 Trong chế biến thuỷ sản, từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tác
dụng của các enzyme tiêu hóa và các enzyme khác có sẵn trong nguyên liệu có tác
động tới quá trình thủy phân cá trong sản xuất nước mắm. Để tăng hiệu quả quá