1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
TRẦN THỊ LIỄU
“NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN
THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY
NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM”
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI - NĂM 2014
2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
TRẦN THỊ LIỄU
một số cây quá già cũng tự đổ gãy dẫn đến suy giảm số lượng loài nghiêm trọng.
Tái sinh tự nhiên hầu như chỉ hạn chế ở giai đoạn cây mầm, lại gặp chủ yếu ở nơi có
khoảng trống, ven đường. Mặt khác lại thiếu vắng các cây tái sinh ở tuổi trung gian,
nên khó đủ sức thay thế những cánh rừng Thông lá dẹt cổ thụ đang tồn tại [5], [6].
Theo Quỹ Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2013 Thông lá dẹt được xếp vào
bậc sắp bị tuyệt chủng VU A2c, B1ab (iii) [65]. Vì vậy, việc bảo tồn hiệu quả
nguồn gen Thông lá dẹt là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu. Tuy
nhiên, các nghiên cứu trước đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc
điểm hình thái và nơi phân bố, còn các nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen
vẫn rất hạn chế và mới chỉ tập trung cho một số loài [7], [8], [46]. Đặc biệt các dẫn
liệu về đa dạng nguồn gen di truyền, các trình tự nucleotide đặc trưng cho loài
Thông lá dẹt hầu như chưa được nghiên cứu.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ
thị phân tử đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở cho
nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tượng sinh vật nói chung và ở các
loài cây lá kim nói riêng [7], [10], [29], [34], [56], [68]. Trong các loại chỉ thị thì
chỉ thị ISSR (Internal Sequence Simple Repeat) và SSR (Sequence Simple Repeat)
đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở
cả mức độ quần thể và loài. Hơn nữa, phân tích phân tử và nhận dạng vùng gen đặc
4
trưng cũng được sử dụng rộng rãi trên thế giới và cả ở Việt Nam để đánh giá các mô
hình đa dạng di truyền ở thực vật và kỹ thuật này có lợi thế tiềm năng cho việc điều
tra thực vật quý hiếm. Vì thế đến nay đã có một số công trình nghiên cứu công bố
về hiệu quả cao của phân tích phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xác
định trình tự nucletide vùng gen đặc trưng cho một số loài lá kim của Việt Nam [2],
[3], [7]. Điển hình là công bố của Vũ Đình Duy và cộng sự (2010) về việc sử dụng
chỉ thị ISSR và SSR đánh giá đa dạng di truyền của 4 loài lá kim là Pơ mu
thuộc:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (phylum): Pinophyta
Lớp (class): Pinopsida
Bộ (order): Pinales
Họ (familia): Pinaceae
Chi (genus): Pinus
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Thông lá dẹt
Theo đánh giá của các nhà khoa học trong và ngoài nước, Thông lá dẹt là
loài cổ sinh vật hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay, với chiều cao lên đến 30 m,
đường kính có thể đạt 1,5 - 1,6 m, đôi khi tới 2 m [47]. Tán của cây thường khá
rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ quạt. Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như không có
cành nhánh, tròn đều và mọc thẳng lên (Hình 1.1). Nón xuất hiện vào tháng 4 - 5 và
tồn tại trên cây trong một thời gian dài. Hạt chín vào tháng 7- 10, màu nâu nhạt và
có cánh trắng. Khi chín, hạt có thể phát tán trong một phạm vi tương đối rộng. Cây
mầm thường có khoảng 10 - 13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn cong về một hướng
như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2 - 3 cm, sau đến là các lá nhỏ mọc quanh thân, dài 1,5
- 2,5 cm. Khi cây còn non, lá dài và rộng bản (dài 10 - 15 cm) xếp như hai lưỡi kéo
ở phần đầu cành. Khi cây trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4 - 5 cm), màu sẫm,
mọc tập trung ở đầu cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn.
Đặc điểm đặc trưng nhất là lá hình dải mác nhọn đầu, dẹt [32], [33].
6
B
A
C
hay ở các vùng núi xa xôi chưa bị lâm tặc vào chặt trộm). Tuy nhiên trong khoảng 5
năm gần đây ở hai tiểu quần thể quan trọng nhất đều thuộc VQG Bi Đúp - Núi Bà
gồm các cây gỗ to lớn ở dọc đường giao thông mới xây dựng từ Khánh Hòa đi lên
Đà Lạt qua VQG Bi Đúp - Núi Bà và đường giao thông đang xây dựng ở Đông
Trường Sơn (từ Đà Lạt ra Quảng Nam) xuất hiện nguy cơ bị lâm tặc chặt hạ và vận
xuất nên ở thời điểm hiện tại việc xếp loài vào thứ hạng sẽ nguy cấp VU A2a,c,d,
A3a,c,d, B2a,c, C1 là hợp lý nhất [4].
1.2. Đa dạng di truyền quần thể thực vật
1.2.1. Khái niệm về quần thể thực vật
Quần thể được định nghĩa là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong một
nơi sống cụ thể, chúng độc lập với các quần thể khác về quan hệ sinh sản [1]. Di
truyền quần thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, và bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả năng sống sót, phương phức sinh
sản, trao đổi và đột biến di truyền. Kích thước quần thể là kết quả của sự tương tác
phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc tính quần thể của
loài. Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương thức sinh
sản, di truyền và tiến hoá. Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế
hệ tiếp theo) trong quần thể và loài. Thụ phấn chéo có thể sản sinh những cá thể lai
đa dạng. Cấu trúc di truyền của những cá thể này đóng góp vào tính đa dạng trong
8
quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao của quần thể trong nhiều môi trường
sống.
Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá vỡ cấu
trúc quần thể hình thành những quần thể nhỏ, cô lập và dẫn đến làm suy giảm khả
năng thích nghi của quần thể với môi trường sống. Trong quần thể, thế hệ sau được
sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác biệt về di truyền giữa các quần
thể là lớn và làm tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ.
cách thức thực hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác
định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật
isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh
những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường
[9].
b) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD được hai nhóm nghiên cứu của Welsh và Clelland (1991) và
Williams và cộng sự (1990) đồng thời xây dựng [70], [71]. Kỹ thuật này dựa trên
ứng dụng kỹ thuật PCR sử dụng các mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên gồm khoảng 10
nucleotide. Số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí
các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome. Sự đa hình của kỹ thuật RAPD
nói chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi làm ngăn trở đến việc bắt cặp của mồi. Kết
quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD – PCR sẽ phát hiện được sự khác nhau trong
phổ các phân đoạn DNA được nhân bản. Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình chiều
dài sản phẩm PCR.
Kỹ thuật RAPD thao tác nhanh, đơn giản, giá thành thấp, dễ thực hiện do
không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, sử dụng lượng
nhỏ DNA khuôn, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao. Tuy
nhiên chỉ thị RAPD là chỉ thị trội do đó những kiểu gen lặn quy định tính trạng nào
đó sẽ khó phát hiện sự đa hình khi điện di sản phẩm [13], [72]. Kỹ thuật RAPD có
độ chính xác không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) [9], [10].
c) Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Đây là kỹ thuật dựa trên tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, do
Botstein và cộng sự (1980) xây dựng vào năm 1980 để lập bản đồ di truyền ở người
[15]. Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên
10
các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ. Số lượng các đoạn
11
e) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)
Kỹ thuật SSR hay microsaterlite (vi vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên
trình tự lặp các đoạn đơn giản trên genome của sinh vật, đây là những trình tự ngắn
(từ 2 đến 6 cặp bazơ, ví dụ (AT)n; (AG)n; (AGTC)n) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao
động từ 2 đến 40 đơn vị. Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và
thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn, phân bố trong hệ gen và có tính đặc
trưng cho từng loài [9].
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên
là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này
được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA ở hai đầu của các
đoạn lặp lại và thiết kế mồi. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên
SSR. Mồi SSR sau đó được sử dụng tương tự như các mồi RAPD. Kỹ thuật SSR có
tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt
được sự sai khác mà không xác định được bằng các chỉ thị khác như RAPD và
AFLP. Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hoá chất. Vì vậy
SSR là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cũng như
lập bản đồ hệ gen ở sinh vật [53]. Mồi sử dụng trong kỹ thuật SSR dài hơn mồi
RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng của loài, vì thế độ tin cậy cao hơn so với kỹ
thuật RAPD. Hơn nữa mồi SSR là các locus đặc trưng, nên cung cấp nhiều thông tin
rất có ích cho việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm. SSR là loại chỉ thị đồng
trội nên đã nhanh chóng thay thế chỉ thị AFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu
hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền.
Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao và khó khăn trong việc thiết kế
cặp mồi đặc hiệu cho một locus đa hình. Để xây dựng cặp mồi đặc hiệu cần tách
dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA hệ gen chứa đoạn lặp lại. Một
vấn đề khác cũng thường gặp trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các
alen với các chỉ thị phân tử là rất khó. SSR có thể được phân bố ngẫu nhiên trong
hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài. Với các giá trị khoa học nêu
trên, đến nay việc xác định trình tự nucleotide vùng gen đặc trưng đang là công cụ
hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết
các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan
hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực vật và vi sinh vật. Hiện
nay, ở Việt Nam hướng nghiên cứu này đang được sử dụng trong nghiên cứu phân
13
loại, định loại, tiến hóa,… trên nhiều đối tượng sinh vật ở Viện Công nghệ sinh học,
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…
1.3.2. Giới thiệu tổng quát về ba vùng gen giải mã trình tự nucleotide
a) Vùng gen thuộc hệ gen lục lạp
Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường
không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb. Không giống như các gen nhân, các
gen lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp. Hệ gen lục
lạp thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền
theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ [55]. Hệ
gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản ánh
đúng mức độ tiến hóa của loài. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 - 5
lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực
vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại. Hiện nay, các vùng
gen matK, trnL - trnF, vùng đệm psbA - trnH, rpoC2…hay được sử dụng trong
nghiên cứu hệ thống học phân tử thực vật. Tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp
thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2 % giữa các loài lân cận.
- Vùng psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại [58].
Vùng này có kích thước xấp xỉ 450 bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100 %
với các loài đã được nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài
trung bình là 1,24 % và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0 – 0,08 % [31].
cho công tác bảo tồn và phục hồi các loài Thông trên thế giới đang là “điểm nóng”
và được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm [25].
Năm 2010, Wang và Hao đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di
truyền của 13 quần thể thông tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.)
[69]. Kết quả chỉ ra rằng tổng số biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung
Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể. Sự đa dạng di tuyền có xu hướng giảm từ
quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên. Cả hai yếu tố phân bố
tự nhiên và hoạt động của con người đều ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc di
truyền của loài này. Hay như nhóm tác giả Mariette và cộng sự (2001) bằng việc
phân tích hai chỉ thị AFLP và SSR đã đánh giá đa dạng di truyền của 23 quần thể
Pinus pinaster xuất xứ từ Aquitaine và Corsican thuộc nước Pháp [39]. Kết quả chỉ
ra rằng những quần thể Pinus pinaster xuất xứ từ Aquitaine có sự đa dạng di truyền
cao hơn so với những quần thể xuất xứ từ Corsican. Ngoài ra còn nhiều nhóm tác
khác trên thế giới cũng đã quan tâm và nghiên cứu vấn đề này như Kadermir và
15
cộng sự (2004) đã nghiên cứu đa dạng di truyền loài thông đỏ Thổ Nhĩ Kỳ [29];
Ledig và cộng sự (2005) nghiên cứu trên loài Picea breweriana [34]; Clark và cộng
sự (2000) đã nghiên cứu trên những loài thuộc chi Abies trong họ Thông [20],…
Đặc biệt thông qua việc phân tích cấu trúc di truyền sử dụng chỉ thị ISSR, AFLP,
của một số loài lá kim bị đe doạ tuyệt chủng cho thấy mức độ đa dạng di truyền bị
suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể
nhỏ và hẹp. Những nghiên cứu đó cũng chỉ ra mức độ đa dạng giữa các quần thể là
rất lớn và đồng thời đưa ra một số biện pháp hiệu quả để phục hồi nguồn gen một số
loài lá kim bị đe dọa tuyệt chủng [18], [73].
Riêng đối với loài Thông lá dẹt, công bố mới nhất về tính đa dạng nguồn gen
quần thể Thông lá dẹt của Việt Nam được xác định bởi nhóm nghiên cứu của Wang
và cộng sự (2014) [68]. Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng 57 mẫu được lấy
konishii) [2]. Hay Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2010) đã giải mã vùng gen rpoC,
gen rbcL và gen matK để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 15 loài lá kim
thuộc lớp Thông (Thủy tùng, Thông đỏ bắc, Bách xanh núi đá, Bách xanh núi đất,
Hồng tùng, Thông Pà cò, Thông tre lá dài, Thông đà lạt, Thông nàng, Thông tre lá
ngắn, Thông ba lá, Kim giao nam, Kim giao bắc, Dẻ tùng vân nam và Thông đỏ
nam) và đã chỉ ra mối quan hệ gần gũi của các loài [8]. Để nghiên cứu mối quan hệ
họ hàng giữa các taxon trong thực vật, Tam và Trang (2012) đã sử dụng vùng gen
18S để xác định mối quan hệ tiến hoá của 6 chi thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae)
ở Việt Nam [58]. Kết quả chỉ ra 2 nhánh tiến hoá có quan hệ mật thiết với nhau,
Xanthocyparis vietnamesis/Cupressus tonkinensis và Fokienia hodginsii/Cupressus
rupestris/C. formasana. Xanthocyparis noothatensis có quan hệ gần gũi với loài
thuộc chi Cupressus. Fokienia hodginsii cùng nhánh tiến hoá với chi Calocedrus.
Tương tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009), Vũ Thi Thu Hiền và cộng sự (2009)
cũng đã sử dụng chỉ thị thị RAPD, ISSR và cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di
truyền cho Pơ mu, Bách xanh phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn [3], [7]. Đến nay có
thể nói, các dẫn liệu về đa dạng di truyền, các trình tự nucleotide đặc trưng cho một
số loài lá kim đặc hữu, có giá trị kinh tế cao và có nguy cơ tuyệt chủng hầu như
chưa được nghiên cứu hoặc rất hạn chế nên cần được quan tâm nghiên cứu để có kế
hoạch bảo tồn cũng như khai thác nguồn tài nguyên quý giá này.
17
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu:
- Gồm 70 mẫu lá và gỗ của 70 cá thể từ 4 quần thể loài Thông lá dẹt (Pinus
krempfii) thu tại 2 tỉnh Lâm Đồng và Đắc Lắc. Các mẫu do TS. Nguyễn Tiến Hiệp,
cộng tác viên của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp. Mẫu lá, gỗ sau khi thu
được bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng. Thông
Số
lƣợng
mẫu
Vị trí địa lí
Kí kiệu
mẫu
Vĩ độ bắc
(◦N)
Kinh độ đông
(◦E)
Độ cao
so mặt
nƣớc
biển (m)
5
Pk1- Pk5 12o11’02.7”N 108o41’24.3”E
1482 1485
11
Pk6-Pk16 14o26’34.0”N
Tên
mồi
Trình tự
nucleotide
1
HB12
(CAC)3GC
[37]
14
ISSR16
(CT)8AC
[45]
2
HB15
(GTG)3GC
[37]
[45]
17
ISSR55
(AC)8T
[69]
5
ISSR3
(GACA)4
[45]
18
ISSR61
(AC)8TG
[69]
6
ISSR5
ISSR7
(GGC)6
[27]
21
UBC811
(GA)8 C
[49]
9
ISSR8
(GAA)6
[69]
22
UBC834
(AG)8 CT
[49]
[69]
13
ISSR11
(CCA)5
[37]
25
UBC854
(TC)8AG
[69]
13
ISSR15
(CA)8A
[45]
26
UBC859
Pt36480
4
P5
Trình tự nucleotide (5’ – 3’)
F GGAAGAAAAATTGGGCCTTA
R CTCTCTATCTCTGCCCCA
F CTTTTGTTTTTCAACAATTGCA
R ACATCTATCTCCCATATCGGC
F TTTTGGCTTACAAAATAAAAGAGG
R AAATTCCTAAAGAAGGAAGAGCA
F GTTCGCTAGTTTGTTTGATCCC
R TCCCAGCAAATCCTTGACTC
Tham khảo
[22]
[20]
[20]
[60]
19
5
Pt9383
PeC26BGT
14
PRE24
15
PtTX3020
16
RPS2
17
RPS160
F AGAATAAACTGACGTAGATGCCA
R AATTTTCAATTCCTTTCTTTCTCC
F AATACTTGGGAGGGATAC
R AATAGCCAGTTTTGTTTG
F CCCGTATCCAGATATACTTCCA
R TGGTTTGATTCATTCGTTCAT
F TCATAGCGGAAGATCCTCTTT
R CGGATTGATCCTAACCATACC
F TTCATTGGAAATACACTAGCCC
R AAA ACC GTA CAT GAG ATT CCC
F GCCAGGGAAAATCGTAGG
R AGAAGATTAGACATCCAACCC
nhân bản vùng gen lục lạp) sử dụng trong nghiên cứu như trong bảng 2.4. Trình tự
của các cặp mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Integrated DNA Technology, Mỹ).
20
Bảng 2.4. Kích thước lý thuyết của các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Vùng
gen
Ký hiệu
cặp mồi
Trình tự nucleotide (5’– 3’)
Kích
thƣớc
lý thuyết
(bp)
1100
Nhiệt độ
bắt cặp
(Tm)C
Nguồn
gốc tổng
hợp
ITS
số
EU490666
Genbank
Taberlet et
al., (2006)
[61]
Sang et al.,
(1997) [50]
Tate et al.,
(2003) [64]
trnL trnF
trnLF/
trnFR
psbA
-trnH
psbA3'f/
trnHf
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:
Hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl,
Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch genomic, Kit tinh sạch sản
phẩm PCR, đệm TAE, agarose, poly acrylamide, TE,...; các hóa chất dùng trong
phản ứng PCR: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, Taq polymerase; hóa chất tinh sạch cản
phẩm PCR và xác định trình tự nucleotide: Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye
Teminator Cycle Sequencing Kit,… Các hóa chất sử dụng đều là của các hãng
Fermentas, Biobasis, QIAGEN, ...
không đặc hiệu. Chúng tôi đã khai thác các dữ liệu trong ngân hàng gen Genbank để
tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho vùng gen ITS đối với loài lá kim. Sau đó sử
dụng phần mềm BioEdit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng để thiết kế cặp
mồi. Cặp mồi ITSF/ITSR nhân bản vùng gen ITS được thiết kế dựa vào trình tự
nucleotide loài Elleanthus conifer mã số EU490666 trên ngân hàng Genbank. Quá
trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar. Hai cặp mồi
psbA3'f/trnHf và trnLF/trnFR được tổng hợp dựa trên những nghiên cứu của Sang
và cộng sự (1997), Tate và cộng sự (2003) và Taberlet và cộng sự (2006).
2.4.3. Nhân bản DNA
Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) với các chỉ thị ISSR và SSR:
Phản ứng nhân gen được thực hiện trên máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng
thể tích 25 µl gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR 1X; MgCl2 2,5 mM; dNTPs
22
2 mM; mồi 100 nM; 50 ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Chu trình
nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94°C trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối
tiếp nhau với các bước: biến tính 94°C trong 1 phút; gắn mồi 50 - 58°C trong 1 phút
(đối với chỉ thị SSR), 46 – 52oC trong 1 phút (đối với chỉ thị ISSR); tổng hợp sản
phẩm 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72°C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở
4°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 5 % cùng với thang
DNA chuẩn 100 bp (của hãng Fermentas), và gel agarose 1,5 % với thang chuẩn
1kb (của hãng Fermentas) sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới
tia UV.
Nhân bản DNA và đọc trình tự: phản ứng PCR được tiến hành với thể tích
25µl, gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR 1X, MgCl2 2,5 mM, dNTPs 2 mM;
0,5 pMl cho một mồi xuôi và ngược, 0,5 đơn vị Taq polymerase và 50 ng DNA
tổng số. Nhân bản DNA được tiến hành trên máy PCR systems 9700 theo chu trình
sau: (1) 94oC: 3 phút; (2) 94oC: 1 phút, 50oC - 51oC: 1 phút, (4) 72oC: 1 phút, lặp lại
khác biệt di truyền (Fst), mức độ di nhập gen (Nm) của mỗi locus SSR và phân tích
mức biến lượng phân tử (AMOVA) của quần thể được tính toán dùng phần mềm
GENALEX 6.3 [50]. Ma trận khoảng cách di truyền được thiết lập để phân tích
thành phần tọa độ (PCA) giữa các quần thể. Lập biểu đồ hình cây theo phương pháp
của Nei (1973) trong phần mềm NTSYS 2.0, version 2.0 [52], giá trị Bootstrap
được hỗ trợ bởi phần mềm Win-Boot [75] với số lần lặp lại 1000 lần
- Xác định trình tự nucleotide
Dữ liệu được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng BioEdit, Mega 4.0,
Clustal X 2.1, DNAstar,…vv. Trình tự nucleotide của loài Thông lá dẹt được so
sánh với các trình tự của vùng gen ITS, trnL-trnF và psbA-trnH đã công bố trên
Genbank.
Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Có 4 phương pháp tạo cây bao gồm: (1)
phương pháp Neighbor – Joining (NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3)
phương pháp Maximum Parsimony và (4) phương pháp UPGMA, trong đó
Neighbor - Joining là phương pháp thường được sử dụng nhất. Khoảng cách di
truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây. được xây
dựng theo phương pháp NJ (Neighbor Joining) [58].
Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment)
được tạo cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor
- Joining (NJ) với các thông số phân tích như sau:
24
- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại
(replicate) là 1000 lần.
- Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra): được
xoá bỏ theo cặp (pairwise deletion).
- Mô hình đột biến: mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột
biến được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A
3.2.1. Tính đa dạng di truyền quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị ISSR
Tính đa hình DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt
Hai mươi sáu mồi ISSR đã được sử dụng để phân tích cho 70 cá thể thuộc
bốn quần thể Thông lá dẹt thu tại Yang Ly, Cổng Trời, Hòn Giao và Chư Yang Sin
Copyright: Tài liệu đại học ©