BỘ G
I
Á
O DỤC VÀ
đÀO
T
Ạ
O
TRƯỜNG
đẠI
HỌC CẦN
T
H
Ơ
KHOA KHOA HỌC -
V
I
ỆN NC&PT CÔNG NGHỆ
S
I
N
H

H
ỌC
ee
LUẬN VĂN TỐT NG
H
I
Ệ
P

nyx

e
x
c
a
v
a
t
u
s
)
đỂ
NUÔ
I
CẤY
VI
S
I
N
H

VẬ
T
C
Á
N

BỘ


ễ
n Thị Xuân Thanh
V
i
ệ
n NC và PT
Công Nghệ
S
i
nh Học Lớp
Công Nghệ
S
i
nh Học
T
r
ư
ờ
n
g

đ
ạ
i
Học Cần Thơ Khóa 31
Cần Thơ, Năm
2009
MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH
Ả

Nguồn carbon
và
năng
l
ư
ợ
ng
.....................................................................7 b.
Nguồn
Nitrogen .........................................................................................7 c.
Nguồn
khoáng
............................................................................................8 d.
Các yếu tố
sinh trưởng
...............................................................................8
2. Các yếu tố lý, hóa học
ảnh hưởng
lên vi sinh
v
ậ
t
........................................10
a. Ảnh
hưởng
của
nhiệt độ
.............................................................................10
b. Ảnh
hưởng

Giai
đoạn
quân bình ...................................................................................13 d.
Giai
đoạn chết
............................................................................................14
4.
Cách đo sự tăng trưởng
của vi sinh
v
ậ
t
.......................................................14
a. Đếm trực
tiếp
.............................................................................................14
b.
Phương pháp gián
tiếp................................................................................14
III. TÌNH HÌNH NGHIÊN
C
Ứ
U
TRONG VÀ
NGO
ÀI
NƯỚC NHÓM
ENZYME PROTEASE .................................................................................15
1.
Trong nước

.............................................................................................19
b. Xác định thành
phần đạm
nguyên
li
ệ
u
........................................................19
2. Sử dụng sản
phẩm
thủy phân của trùn quế
để
nuôi vi sinh
vật
....................20
a. Thí nghiệm 1: xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp
cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH
5

..........................................20
b. Thí nghiệm 2: theo dõi sự phát trển của vi khuẩn E. Coli DH
5

theo
thời
gian...............................................................................................................20
c. Thí nghiệm 3: xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi
trường YEB nuôi cấy Saccharomyces
cerevisiae
...........................................21

d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo
thời gian .......................................................................................................28
3. Hiệu quả kinh tế giữa
bột đạm
từ trùn quế và bột pepton Hà
Lan
..................31
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ
NGH
Ị
...............................................................33
I. Kết
luận
........................................................................................................33
II. Đề nghị .........................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM
KH
Ả
O
PHỤ
L
Ụ
C
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Danh sách bảng
Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn.................6
Bảng 2:
Nguồn
carbon và
nguồn năng lượng

thành
1 lít
môi trường
YEB
..................................................................32
Danh sách hình ảnh
Hình 1. Trùn
quế
.....................................................................................................3
Hình 2. Môi
trường lỏng trước
và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH
5

16
gi
ờ
........24
Hình 3. Sự
tăng trưởng
của vi khuẩn E. coli DH
5


trên
hai môi
trường
đạm pepton
và
đạm

gi
ờ
.........................................30
1
TÓM
L
ƯỢ
C
Đề tài được thực hiện nhằm mở ra một hướng ứng dụng mới của sản phẩm tự
thủy phân từ trùn quế. Sản phẩm được thử nghiệm thay thế nguồn đạm pepton ở
các mức độ 0, 25, 50, 75 và 100% trên hai môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn
Escherichia coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces
cerevisiae.
Kết quả cho thấy, với cùng một lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, nghiệm thức thay thế hoàn toàn đạm trùn quế 100% đạt kết quả cao nhất trên
cả hai chủng vi sinh vật. Đồ thị tăng trưởng theo thời gian trên hai môi trường
đạm thủy phân từ trùn quế 100% và đạm pepton Hà Lan 100% tương tự nhau. Ở
giai đoạn log, cả hai môi trường LB và YEB dịch đạm trùn quế thủy phân được
thay thế 100% sự tăng sinh khối từ bằng đến cao hơn so với nuôi cấy trên môi
trường chứa đạm pepton và đạt đến OD
600nm
cao nhất sau 18 giờ tăng trưởng.
Trên môi trường thạch, với thành phần đầy đủ chất dinh dưỡng trong dịch đạm
thủy phân trùn quế cũng đã cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn khi nuôi cấy trên
môi trường chứa đạm pepton.
Giá thành 1 lít môi trường nuôi cấy chứa đạm trùn quế thủy phân giảm một nửa
so với dùng đạm pepton Hà Lan. Vì thế việc sử dụng nguồn đạm thủy phân từ
trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá
trị thương phẩm của loài trùn đất đang được nuôi công nghiệp hiện nay.
2

vi
sinh
vật”
Mục tiêu của đề tài: So sánh hiệu quả sử dụng giữa nguồn đạm thủy phân từ trùn
quế với peptone thương mại hiện đang sử dụng trong nuôi cấy các chủng vi
khuẩn và nấm men phổ biến.
PHẦN II:
L
ƯỢ
C
KHÁO TÀI
L
I
Ệ
U
I. Trùn
qu
ế
1. Vị trí
phân
loại
Trùn quế thuộc:
Ngành: Giun đốt (Annelida).
Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata).
Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta).
Họ: Megascolecidae.
Tên khoa học: Perionyx excavatus
2.
Đặc tính sinh
họ

nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quế
nằm trong khoảng từ 20 – 30
o
C, ở nhiệt độ khoảng 30
o
C và độ ẩm thích hợp,
chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng
hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi
hoặc chết. Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng
lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi Oxy.
Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợp
nhất vào khỏang 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khá
rộng, từ 4 – 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi.
Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ
nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…).
Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn,
giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn.
Trong tự nhiên, Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi có
nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, các
đống rác hoai mục. Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi
đây có nhiều chất thải hữu cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường
cao, không hấp dẫn và không đảm bảo điều kiện ẩm độ thường xuyên.
(Nguồn: http://Agriviet.com)
4.
Công dụng của trùn qu
ế
Trùn quế dễ nuôi, chóng lớn và có tốc độ sinh sản nhanh. Hiện nay nuôi trùn quế
đã trở thành ngành chăn nuôi công nghiệp phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi,
dược phẩm, mỹ phẩm…
Trùn quế có hàm lượng đạm cao nên được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý

r
on
g

tế bào
vi khuẩn.
Nguyên
t
ố
%
(theo t
r
ọn
g
lượng
k
h
ô)
Nguồn Vai trò
Carbon 50
CO
2
hay các hợp
chất hữu cơ
Thành phần chính trong vật liệu
tế bào
Oxygen 20 H
2
O, CO
2

teichoic
Sulfur 1 SO
2
, H
2
S, SO,
hợp chất sulfur
hữu cơ
Thành phần của Cystein,
methionin, glutathion, nhiều
coenzyme
Potassium 1 Muối potassium Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme
Magnesium 0,5 Muối
maggnesium
Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme
khác
Calcium 0,5 Muối calcium Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme và
cấu tử của nội bào tử
Sắt 0,2 Muối sắt Cấu tử của cytochrom và protein
có sắt và là cofactor cho một số
phản ứng có enzyme xúc tác.
(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)
.
a.
Nguồn carbon
và
năng

t
ổn
g
hợp các cấu tử tế
b
à
o
Vi sinh vật quang tự
dưỡng
Ánh sáng
CO
2
Vi sinh vật quang dị
dưỡng
Ánh sáng Hợp chất hữu cơ
Vi sinh vật hoá tự dưỡng
Hợp chất vô cơ, H
2
, NH
3
,
NO
2
-
, Fe
2+
, H
2
S
CO

oge
n
Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn đạm hữu cơ và vô cơ cần thiết cho tế bào sẽ
khác nhau. Nguồn đạm mà vi sinh vật thường dùng nhất là protein, acid amin,
NH
3
, NH
4
+
và NO
3
-
N
2
trong không khí là nguồn dinh dưỡng nitơ của nhóm vi
sinh vật cố định nitơ.Vi sinh vật cần có đủ đạm để tổng hợp các acid amin,
protein, acid nhân, lipid, carbohydrate và các coenzyme cho cơ thể.
c.
Nguồn
kho
á
ng
Sulfur: thường được cung cấp từ các sulphate. Cần thiết để tế bào tổng hợp acid
amin, vitamin và các carbohydrate.
Phospho: thường được cung cấp dưới dạng vô cơ hay hữu cơ. Phospho cần thiết
cho các phản ứng tổng hợp acid amin, phospholipid, ATP, coenzyme và protein. Ở
nồng độ phospho thấp có thể giới hạn sự tăng trưởng của tế bào.
Sắt: cần cho chức năng của enzyme, hệ thống cytochrom.
Các nguyên tố khoáng khác như K, Na, Mg, Ca, Mn …cũng rất cần thiết đối với
vi sinh vật, thiếu nó vi sinh vật không thể sinh trưởng phát triển bình thường

Vitamin Coenzyme có
thành
phần
vita
m
i
n
Vai
trò
Acid folic Tetrahydrofolat (FH4) Chuyển các đơn vị có một cacbon
và cần cho sự tổng hợp thymin,
purin, serin, methionin và
pantothenat
Biotin (vitamin
H)
Biotin Các phản ứng sinh tổng hợp cần
sự cố định CO
2
Acid lipoic Lipoamid Chuyển các nhóm acyl trong sự
oxit hóa các acid keto
Acid mercapto-
ethalsulfonat
Coenzyme M
Sản xuất CH
4
bởi các vi sinh vật
sinh mêtan
Acid nicotinic NAD
+
và NADP

12
Cobalamin Chuyển nhóm methyl
Vitamin K Quinon và naptho-
quinon
Vận chuyển điện tử
(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)
2.
Các
yếu tố
lý,
hóa học ảnh hưởng lên
vi
sinh
vật
a.
Ảnh hưởng của nhiệt
đ
ộ
Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh sản của vi sinh vật
mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (do ảnh hưởng đến tốc độ của các phản
ứng hóa học và sinh hóa học).
Căn cứ vào nhiệt độ tối ưu của sự phát triển, người ta phân biệt thành các loại vi
sinh vật sau:

Những vi sinh vật ưa ấm trung bình (Mesophiles) ưa thích ở nhiệt độ trung
bình khoảng 20
o
C - 40
o
C (tối ưu 30

C hay hơn nữa.
b.
Ảnh hưởng của
oxy
Tuỳ theo khả năng sử dụng oxy phân tử mà người ta phân biệt thành các nhóm:
+ Các vi sinh vật hiếu khí đòi hỏi oxy tự do để phát triển
+ Các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc chỉ có thể phát triển trong điều kiện không
có oxy không khí (bởi vì chúng không có catalase, superoxyde dismutase, do đó
không có thể loại bỏ được các sản phẩm oxy hóa độc hại cho tế bào như nước
oxy già (H
2
O
2
) và các ion superoxyde )
+ Các vi sinh vật hiếu khí, kị khí hoặc kị khí không bắt buộc có thể
sinh
trưởng phát triển khi có hoặc không có oxy tự do
+ Các vi sinh vật vi hiếu khí chỉ có thể phát triển trong môi trường có nồng
độ oxy phân tử thấp.
Một số nấm men có thể sinh trưởng và phát triển chậm trong môi trường gần như
kị khí, khi đó chúng tiến hành lên men. Có vài loài nấm mốc, như Penicilium
requeforti là những cơ thể hiếu khí nhưng có thể chịu sống trong môi trường có
hàm lượng oxy thấp. Các vi khuẩn thì gồm nhiều loại, trải ra từ kị khí đến hoàn
toàn hiếu khí.
c.
Ảnh hưởng của ẩm
đ
ộ
Nước chiếm hơn phân nửa trọng lượng tế bào vi sinh vật, vì vậy đa số vi sinh vật
chỉ phát triển được khi môi trường có nước. Tuy nhiên, có một số nấm có khả

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng kháng được điều kiện acid và kiềm của môi
trường chung quanh tế bào. pH bên ngoài tế bào có thể rất biến động nhưng pH
bên trong tế bào thì cố định.
Trong việc bảo quản thức ăn, người ta muối thức ăn và cho thêm một ít acid vào.
Acid sẽ có tác dụng ngăn cản vi sinh vật phát triển nên thức ăn không bị hỏng.
Tuy nhiên, pH thấp chỉ có tác dụng với vi khuẩn mà thôi còn các loại nấm mốc
thì không có tác dụng vì chúng thích hợp với môi trường acid.
f.
Ảnh hưởng của áp suất thẩm
thấu.
Nồng độ của muối khoáng trong môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng
trưởng của vi sinh vật.Thông thường vi sinh vật có thể phát triển ở các nồng độ
muối khoáng rất khác nhau. Khi nồng độ muối khoáng bên ngoài tế bào cao hơn
bên trong tế bào thì nước từ tế bào sẽ thoát ra ngoài môi trường làm tế bào bị co
lại và ngược lại khi nồng độ muối khoáng trong tế bào cao hơn môi trường, nước
từ môi trường sẽ đi vào tế bào làm tế bào trương to. Trong trường hợp này vỏ tế
bào sẽ giúp giữ cho tế bào không bị vỡ ra. Một số vi khuẩn có thể chịu được
nồng độ muối khoáng cao như trường hợp của Staphylococcus aureus có thể chịu
được nồng độ muối của môi trường bên ngoài tế bào lên đến 3M. Có loài nấm
men Saccharomyces có thể chịu được nồng độ đường cao.
Căn cứ trên nhu cầu về muối cần thiết cho sự tăng trưởng, người ta chia vi sinh
vật làm 3 loại:
- Vi sinh vật không chịu mặn, phát triển ở môi trường không có hay rất ít muối
như trường hợp vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas
- Vi sinh vật ưa mặn: cần muối để phát triển. Vi sinh vật nhóm này có thể chia
làm 3 loại:
+ Vi sinh vật ưa mặn ít: phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối
từ 1-6%
+ Vi sinh vật ưa mặn trung bình: phát triển tốt ở môi trường có nồng độ
muối từ 6-15%

Trong giai đoạn này sự tăng trưởng và phân cắt của tế bào rất chậm. Do đó
đường biểu diễn có độ dốc nhỏ. Giai đoạn này được giải thích là khi chuyển vi
khuẩn từ môi trường cũ sang môi trường mới có thành phần thức ăn khác nhau
hay từ mẻ cấy già sang mẻ cấy mới điều chế vi khuẩn cần có thời gian để tổng
hợp các enzyme, coenzyme…để thích hợp với môi trường mới và nếu môi
trường mới giống môi trường cũ thì giai đoạn chậm không xảy ra.
b. Giai
đoạn
l
o
g
Khi vi khuẩn bắt đầu thích hợp với môi trường mới thì cường độ tăng trưởng
nhanh, đường biểu diễn có độ dốc lớn. Cường độ này tùy thuộc vào thành phần
môi trường và điều kiện ủ.
c. Giai
đoạn quân
bình
Khi thức ăn trong môi trường giảm và do sự tích tụ chất độc do vi khuẩn tiết ra,
số tế bào mới sinh bằng số tế bào chết đi nên đường biểu diễn nằm ngang.
d. Giai
đoạn
ch
ết
Cứ theo đà tiến triển trên, thức ăn ngày càng kiệt quệ, lượng chất độc tích tụ gia
tăng, số tế bào chết cao hơn tế bào sống, đây là giai đoạn chết. Tuy nhiên, người ta
có thể giữ mãi giai đoạn log bằng cách hàm cho hàm lượng thức ăn trong môi
trường không giảm. Đây là một mẻ cấy liên tục.
4. Cách
đo sự tăng trưởng của
vi

o
C, để nguội, môi trường đặc lại,
đem ủ trong tủ ủ và đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốn
đếm. Phương pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi sinh vật sống
mới phát triển thành khuẩn lạc. Phương pháp này mất nhiều thời gian.
Phương pháp đếm điện tử: Người ta dung máy đếm điện tử. Nguyên tắc là
sự thay đổi đột ngột của điện trở được ghi thành một chấn động. Điện trở ở
một
khe
có chất lỏng chảy qua, số tế bào vi sinh vật làm điện trở gia tăng. Điểm bất
lợi là chấn động được tạo ra với cả hạt bụi nên máy phải thật sạch.
Phương pháp quang học: Dùng quang phổ kế. Chiếu một chùm tia sáng qua
một ống nghiệm chứa vi khuẩn, độ đục của môi trường làm giảm cường độ của
chùm tia sáng và được ghi nhận trên một khung chia thành đơn vị OD. Vì số ánh
sáng tương ứng với mật số tế bào nên người ta so sánh với đường biểu diễn
chuẩn để suy ra mật số tế bào trong một đơn vị thể tích.
III. Tình
hình nghiên cứu trong
và
ngoài nước nhóm enzyme
p
r
o
tease
Hiện nay, ở nước ta và trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về việc
nghiên cứu sử dụng sản phẩm từ enzyme protease.
1.
Trong
nư
ớc

phần acid amin cao hơn phương pháp truyền thống và các phương pháp bổ sung
các enzyme thương mại : NFĐ, Neutrase, Flavourzyme.
và ctv. (2005) nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một
số nguồn khác nhau và ứng dụng để sản xuất chitin từ phế liệu tôm và cải tiến
quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành. Kết quả cho thấy nguồn thu nhận có
hiệu quả nhất là vi sinh vật. Từ đó đã xây dựng được quy trình thu nhận chế
phẩm

protease

từ

Bacillus

subtilis

cồn tốt nhất ở nhiệt độ 50
5 giờ. Sản xuất
nước chấm bằng phương pháp kết hợp enzyme-acid cho phép giảm lượng acid sử
dụng, rút ngắn chu kỳ sản xuất và hạ giá thành sản phẩm.
2.
Ngoài
nư
ớc
Nielsen

P.M.

el


TIỆN VÀ
PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN
CỨU
I.
Ph
ư
ơ
n
g

tiện nghiên
cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học
1. Nguyên liệu
Trùn quế đã đông khô trữ lạnh ở -20
o
C.
2.
Thiết
bị và
dụng
cụ
Một số thiết bị như: tủ ủ (Ehret), máy quang phổ kế (U-1500, Hitachi), máy ly
tâm (Centaur 2, U.K), máy khuấy từ (Heidolph, Germany), máy đo pH (inoLab),
bếp điện, cân phân tích, buồng cấy vi sinh vật, máy lắc ủ (Heidolph, Germany),
nồi khử trùng.…..
Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong,
ống nghiệm, micropipet, que cấy…


pháp nghiên
cứu
1. Chuẩn
bị
mẫu
và
xác định thành phần đạm nguyên
liệu
a.
Chuẩn
bị mẫu
- Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm < 5%) và trữ lạnh ở -20
o
C.
Đem xay mịn bằng máy xay sinh tố rồi tiến hành tự thủy phân với các điều kiện
tối ưu cho quá trình tự thủy phân đã được nghiên cứu theo Phạm Thị Quỳnh
Trâm (2008).
- Tiến hành: Cân 26,52 gam trùn quế sấy đông khô đã xay mịn, bổ sung 173,48
ml nước cất, dịch thủy phân đạt nồng độ protein 9%. Thuỷ phân trong 24 giờ ở
nhiệt độ 55
o
C.
Cân lượng pepton Hà Lan (độ ẩm < 6 %) tương đương trùn quế sấy đông khô pha
trong cùng lượng nước cất. Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan và
đạm amin.
b. Xác
định thành phần đạm nguyên
liệu
Hàm lượng đạm tổng số