ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
Nguyễn Ngọc Hưng
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ AXÍT BÉO TRONG DẦU GẤC
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

1.2.2. Axít oleic ............................................................................................................ 7  
1.3. Các phương pháp phân tích axít béo....................................................................... 8 
1.3.1. Các phương pháp chung ..................................................................................... 8 
1.3.2. Các phương pháp sắc ký ................................................................................... 12 
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 24 
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................... 24 
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu................................................................... 24
 
2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................ 25 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 26 
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí ..................................................................................... 26 
2.2.2. Định lượng các axit béo bằng GC – FID ........................................................... 32 
2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ............................................................. 33 
2.3. Hóa chất và dụng cụ............................................................................................. 34 
2.3.1. Hóa chất ............................................................................................................. 34 
2.3.2. Dụng cụ .............................................................................................................. 35 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 36 
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu đối với việc phân tích các axít béo ............... 36 
3.1.1. Lựa chọn c
ột tách .............................................................................................. 36 
3.1.2. Khảo sát chương trình nhiệt độ cột tách ........................................................... 36 
3.1.3. Khảo sát tốc độ khí mang ................................................................................. 39 
3.1.4. Khảo sát thể tích bơm mẫu ............................................................................... 41 
3.1.5. Tổng kết điều kiện chạy sắc ký ......................................................................... 43 
3.2. Tối ưu hóa quá trình metyl este hóa ...................................................................... 43 
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích NaOH/MeOH 0,5M ....................................... 43 
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích BF
3
/MeOH 20% ........................................... 46 
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian este hóa ............................................................. 48 

ỉ mỉ và chi tiết.
Để đóng góp thêm phương pháp phân tích cho đối tượng này, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu các điều kiện tách cũng như xác định đồng thời hai axít
béo không no có hàm lượng cao trong dầu Gấc là axít oleic và axít linoleic
bằng phương pháp sắc ký khí (GC) sử dụng detector FID.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Cây Gấc và dầu Gấc
1.1.1. Cây Gấc
Gấc có tên khoa học là Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng, họ
Bí (Cucurbitaaceae) bộ Violales. Gấc còn có tên khác là Muricia
cochinchinensis Lour., Momordica macrophuylla Gage, Momordica mixta
Roxburgh.
Ở một số nước, Gấc được gọi là: Mộc Miết (Trung Quốc), Spiny bitter-
cucumber, Chinese bitter-cucumber, Chinese cucumber (Anh), Margones à
piquants (Pháp), Makkao (Khơ me) [1,5].
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Gấc là loài cây thân thảo dây leo thuộc chi Mướp đắng. Cây gấc leo
khỏe, chiều dài có thể đến 15m. Thân dây có tiết diện góc. Lá gấc nhẵn, thùy
hình chân vịt phân ra từ 3 đến 5 dẻ, dài 8-18 cm. Gấc là loài đơn tính khác
gốc (
dioecious). Hoa sắc vàng. Quả hình tròn, sắc xanh, khi chín chuyển sang
màu đỏ cam, đường kính 15-20 cm. Vỏ gấc có gai rậm. Bổ ra mỗi quả thường
có sáu múi. Thịt gấc màu đỏ cam. Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, có khía.
Gấc trổ hoa mùa hè sang mùa thu, đến mùa đông mới chín. Mỗi năm gấc chỉ
thu hoạch được một mùa. Do vụ thu hoạch tương đối ngắn (vào khoảng tháng
12 hay tháng 1), nên gấc ít phổ biến hơn các loại quả khác.
1.1.1.2. Thu hái

vào chảo dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60 – 70
0
C. Dầu lạc hay
mỡ lợn sẽ hòa tan chất dầu chứa trong màng dầu Gấc.
Dầu Gấc sau đó được bảo quản trong chai màu nâu, đóng đầy, nút kín.
1.1.2.2. Tính chất lý hóa
- Dầu Gấc là chất lỏng, sánh, trong, màu đỏ máu, mùi thơm ngọt đặc
biệt, vị béo, không khé cổ. Nếu để lâu hoặc ỏ nhiệt độ 0 – 5
0
C xuất hiện
cặn, cặn đó là các tinh thể carotenoid.
- Độ hòa tan: Dễ tan trong ete dầu hỏa, cloroform và ete.
- Tỷ trọng: D = 0,9151 – 0,9156 g/cm
3
ở 15
0
C.
4

- Chỉ số khúc xạ: 1,4681 – 1,4685 [2].
- Thành phần hóa học: 100g dầu này có 150 - 175mg β - caroten, khoảng
4g lycopen và 12mg alpha tocopherol (vitamin E thiên nhiên). Axít
panmitic (33,4%), axít stearic (7,9%), đặc biệt là các axít không no như
axít oleic (44%) và axít linoleic (14,7%) là hai axít béo rất cần thiết cho
cơ thể. Dầu Gấc cũng còn chứa các vi lượng cần thiết như: sắt, đồng,
coban, kali và kẽm ...[1,5].
1.1.2.3. Tác dụng sinh học và công dụng
Khi vào cơ thể, β - caroten (chất tiền vitamin A) sẽ được chuyển hoá
thành vitamin A tuỳ theo nhu cầu, vì vậy khi dùng dầu gấ
c, không có hiện

dụng của 75% những chất gây bệnh ung thư nói chung, đặc biệt ung thư vú.
Nó được dùng cho bệnh nhân bị ung thư sau khi cắt bỏ khối u, sau hoá trị và
xạ trị. Axít linoleic trong dầu gấc là một vitamin F, có ảnh hưởng đến chuyển
hoá các lipit, phospholipit, giúp cơ thể thải bớt cholesterol chống nhiễm mỡ
và làm vững bền thành mạch máu. Nó c
ũng có tác dụng bảo vệ da và tăng sức
chống đỡ của cơ thể.
Dầu gấc còn kích thích sinh ra lớp mô mới, làm cho vết thương mau
lành, để chữa các vết bỏng, loét và nứt kẽ vú … [4].
1.2. Tổng quan về axít béo không no
Dầu Gấc chứa nhiều các axít béo no và không no, trong đó có các axít
không no oleic (ω
9
) và linoleic (ω
6
) là nhiều hơn cả. Đây là các axít quan
trọng nhất vì nó cần thiết cho sự phát triển của cơ thể con người. Các axít này
cũng được gọi là các vitamin F [7],[12],[30].
1.2.1. Axít linoleic
- Công thức cấu tạo

6

- Tên IUPAC: axít (9Z, 12Z) – octadeca – 9,12 – dienoic.
- Công thức phân tử : C
18
H
32
O
2
7

1.2.2. Axít oleic
- Công thức cấu tạo

- Tên IUPAC: axít (9Z) – octadec – 9 – enoic.
- Công thức phân tử : C
18
H
34
O
2
.
- Khối lượng phân tử: 282,4614 g.mol
-1
.
- Tỉ khối: 0,895 g.cm
-3
.

- Điểm nóng chảy: 14
0
C.
- Điểm sôi: 360
0
C.
- Tên khác: Omega 9.
- Tác dụng:

Vào năm 2005, Bahruddin Saad và các cộng sự đã kết hợp phương
pháp tiêm dòng chảy và phương pháp chuẩn độ khi xác định các axít béo t
ự
do có trong dầu cọ. Hệ thống 1 kênh và 2 kênh thuốc thử đã được khảo sát
với các thuốc thử lần lượt là phenolphtalein và bromthymol xanh. Phương
pháp trên cho thời gian phân tích khá nhanh với số lượng là 35 – 74 và 21 –
46 mẫu / giờ đối với hệ thống 1 và 2 kênh. 50 mẫu dầu cọ đã được khảo sát và
được so sánh với phương pháp PORIM, kết quả cho thấy 2 phương pháp có
độ tương quan cao (R
2
= 0,92). Mặt khác, phương pháp trên không bị ảnh
9

hưởng của màu nền của mẫu khi phổ hấp thụ UV-VIS chỉ ra rằng độ hấp thụ
của mẫu là cực tiểu tại bước sóng phát hiện của phenolphthalein (562 nm) và
bromthymol xanh (627 nm) [11].
1.3.1.2. Phương pháp chuẩn độ đo nhiệt (trong môi trường không nước)
Phương pháp chuẩn độ đo nhiệt dựa trên kỹ thuật CETT, Catalyzed
Endpoint Thermometric Titrimetry [29]. Kỹ thuật này tương tự như chuẩn độ
hóa học thông thường nhưng lượng d
ư ion OH
-
sau khi trung hòa các axít béo
trong mẫu được dùng làm xúc tác cho một phản ứng tỏa nhiệt mạnh giữa các
cấu tử trong hỗn hợp dung môi (axeton và clorofom, 25/2, v/v) dùng để hòa
tan mẫu các chất béo hay mẫu dầu.
Phương pháp sử dụng một đầu đo nhiệt độ đơn giản và cho kết quả
phân tích nhanh khi được tự động hóa. Thời gian phân tích thường chỉ mất từ
1 – 3 phút với độ chính xác cao. Ngoài ra đầu dò nhiệt không cần phải chuẩn
hóa trước khi

sánh với dung dịch chuẩn gốc của các axít béo.
Vào năm 2005, Marta Bernárdez [26] và các cộng sự đã biến điệu
phương pháp Lowry khi phân tích các axít béo tự do trong thịt cá. Ông đã
thay thế dung môi benzen bằng dung môi ít độc hơn là xiclohexan. Mẫu chất
béo làm khô được hòa tan trong 3 ml xiclohenxan và trộn lẫn với 1 ml thuốc
thử đồng axetat – pyridin. Sau khi lắc đều và li tâm, lớp trên c
ủa hỗn hợp
được chiết ra và đem đo quang ở bước sóng 715 nm. Kết quả cho sự tương
quan cao khi so sánh với phương pháp chuẩn độ truyền thống.
1.3.1.4. Phương pháp enzim
Phương pháp enzim cũng được dùng để xác định lượng nhỏ các axít
béo tự do có trong huyết thanh và huyết tương. Phương pháp dựa trên sự axyl
hóa các axít béo mạch không phân nhánh bởi enzim acyl-CoA synthetase
(ACS) tạo ra một lượng tương đương acyl-CoA và AMP (adenosine
monophosphate). Sau đó sử dụng các phản ứng ghép cặp c
ủa AMP với
myokinase (MK), pyruvate kinase (PK) và lactate dehydrogenase (LHD) để
tạo ra NADH (nicotinamide adenine dinucleotide). NADH được xác định
bằng phương pháp huỳnh quang.
Vào năm 1992, Jebens E. [23] và các cộng sự đã dùng phương pháp
trên để xác định một lượng nhỏ các axít béo bằng cách chiết chúng với thuốc
thử Triton X-100. Các phép đo được tiến hành lặp lại trong 5 mẫu của mẫu
huyết thanh và huyết tương với khoảng nồng độ từ 0 đến 2 mmol.l
-1
. Kết quả
thu được khá tốt với hệ số biến thiên giữa các mẫu và trong mỗi mẫu lần lượt
là 1,7 và 4%.

11


1.3.2. Các phương pháp sắc ký
Từ khi ra đời đến nay, sắc ký vẫn luôn là phương pháp hữu hiệu nhất
khi cần xác định riêng rẽ các chất trong cùng một hỗn hợp. Trong khi đó các
axít béo hay đi cùng với nhau và việc xác định riêng biệt chúng là một việc
làm cần thiết. Việc áp dụng các phương pháp sắc ký xác định các axít béo
hiện nay là phương pháp phổ biến và có rất nhiều công trình nghiên cứu về
vấn đề nay. Trong khuôn khổ của luận văn ch
ỉ đề cập đến các qui trình nghiên
cứu chính khi sử dụng phương pháp sắc ký trong phân tích axít béo.
1.3.2.1 Phương pháp sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí được xem là phương pháp hữu hiệu nhất hiện nay dùng để
phân tích các axít béo trong các loại nền mẫu khác nhau. Tuy nhiên do sắc ký
khí chỉ áp dụng đối với những chất dễ bay hơi trong khi các axít béo có trong
tự nhiên đa số có nhiệt độ sôi cao nên chúng phải được dẫn xuất hóa. Do đó
một qui trình xác định axít béo bằng sắc ký khí thường bao g
ồm 2 giai đoạn
chính là dẫn xuất hóa và xác định.
a) Các phương pháp dẫn xuất hóa axít béo:
Trước khi phân tích sắc ký khí, việc làm đầu tiên là chuyển hóa các axít
béo thành các dẫn xuất dễ bay hơi như là metyl este hay các dẫn xuất khác.
Các lipid trong chất béo, dầu thực vật thường được este hóa để chuyển
glyxerol thành các ancol nhẹ hơn (metanol hay butanol . . . ) trong môi trường
axít (HCl, H
2
SO
4
hay BF
3
).
Quá trình metyl este hóa không những có thể thực hiện trong môi

3
/metanol
được cho vào. Sau đó, đóng chặt nút xoắn, đun nóng trong nước sôi (hoặc bếp
cách cát ở 100
0
C). Thởi gian đun tùy thuộc dạng mẫu, thông thường từ 5 – 45
phút.
14

Ống nghiệm sau đó được làm lạnh, thêm vào đó 1 ml nước và 2 ml
pentan. Lắc ống nghiệm trong vòng 1 phút, ly tâm tại tốc độ thấp và chiết lấy
pha hữu cơ ở trên. Pentan được cho bay hơi và phần dư được hòa tan trong 50
– 100 µL hexan ngay lập tức. Dung dịch trên được đem tiêm trực tiếp vào cột
sắc ký khí.
+ Các phương pháp khác:
* Vào năm 2008, Ernesto Mendez Antolin và các cộng sự [16] đã nghiên
cứu 5 phương pháp tạo dẫn xuất khác nhau khi xác định các axít béo no từ C
24

– C
36
. Các phương pháp tạo dẫn xuất bao gồm:
- Metyl hóa bằng diazometan
- Metyl hóa với hỗn hợp axít sulfuric – metanol
- Metyl hóa với hỗn hợp axít clohidric – metanol
- Metyl hóa với hỗn hợp BF
3
– metanol
- Metyl hóa bằng N-metyl-N-trimetylsilyltrifloaxetamit.
Sau khi đánh giá các thông số như giá thành, tốc độ phân tích, tính an

C. Các glyxerollipit có thể chéo hóa este trong vòng 2 – 5
phút khi sử dụng phương pháp này tại nhiệt độ phòng.
Vào năm 1996, Ichihara K. và cộng sự [21] đã có cải tiến qui trình trên
để phân tích nhanh các axít béo trong trianxylglyxerol và photpholipit như
sau:
+ Hóa chất: n-hexan, dung dịch KOH/metanol 2M.
+ Qui trình:
Ống nghiệm chứa 20 - 40 mg chất béo được hòa tan trong 2 ml n-
hexan, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,2 ml KOH/metanol 2 M. Ống nghiệm được
lắc mạnh trong 2 phút tại nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm nhẹ, chiết lấy lớp n-
16

hexan ở trên để bơm vào cột GC. Phương pháp trên không dùng được cho
sterol este và sáp.
Ichihara K và các cộng sự cũng đã biến đổi phương pháp trên để điều
chế trực tiếp các este metyl của axít béo từ các lipit phân cực (photphotlipit)
trong hỗn hợp chất béo mà không cần phải phân lập trước [22]. Quá trình
metyl hóa các glyxerollipit phân cực trong hỗn hợp chất béo xảy ra hoàn toàn
trong 2,5 phút khi sử dụng máy khuấy và 20 phút khi lắc với dung dịch KOH
0,7M trong metanol với sự có mặt của n-hexan ở 30
0
C. Hiệu suất của quá
trình este hóa lớn hơn 95% và phương pháp trên được ứng dụng khi phân tích
thành phần các glyxerollipit phân cực trong dầu thực vật và mẫu máu. So với
các phương pháp truyền thống thông qua sự chiết lipit bởi cloroform/metanol,
phương pháp trên không có sự sai khác đáng kể và cho thời gian cũng như
hiệu quả phân tích nhanh, chính xác.
• Quá trình metyl hóa trực tiếp:
Đối với một lượng mẫu nhỏ như mẫu mô từ 1 – 10 mg, mẫu chất lỏng
sinh họ

nhanh thời gian phân tích. Quá trình chéo hóa este trực tiếp được thực hiện
trong lò vi sóng ở 90
0
C trong khoảng thời gian 30 giây, trong khi các quá
trình khác cần từ 1 – 2 giờ. Hơn nữa phương pháp này cho hiệu suất thu hồi
cao đối với mỗi axít béo no và không no. Thành phần của các axít béo cũng
không bị ảnh hưởng bởi các bức xạ vi sóng.
b) Xác định axít béo bằng GC:
Các axít béo sau khi este hóa được bơm vào cột GC. Tùy thuộc vào
thành phần và tính chất của axít béo mà ta có thể sử dụng các cột tách và các
qui trình khác nhau. Bảng 1.1 cho biết một số cột tách sử dụng để phân tích
axít béo trong thực ph
ẩm [28].
18

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của một vài pha tĩnh thông dụng dùng để
phân tích axít béo trong thực phẩm bằng GC
Thành phần hóa học Tên thương mại Độ phân
cực
Ứng dụng
100% Cyanopropylsilicon CP – Sil – 88 (Silar
-10c)
VP Dầu đậu
nành
100% Cyanoetylsilicon SP – 2340, OV –
275
VP Sữa, dầu
thực vật đã
hydro hóa
Metylsilicon polyme, 25%

P Men, bơ, dầu
đậu nành,
dầu các hạt
cây, dầu hạt
cây bông
95% Dimetyl – 5 %
diphenylpoysiloxan
DB-5, SPB-5, CP-
SIL 8CB
NP Dầu hạt cây
bông, dầu
thực vật
100% Dimetylpolysiloxan DB-1, Rt-1, SPB-1,
SP-2100, OV-1,
OV-101, CP-SIL
5CB
NP Men
86% Dimetyl – 14%
cyanopropylphenylpolyxiloxan
DB - 1701 P Men
(Chú thích: VP: rất phân cực, P: phân cực, NP: không phân cực).
19

Tùy thuộc vào cột tách và thành phần mẫu mà ta có các điều kiện phân
tích khác nhau. Sau đây xin giới thiệu một vài điều kiện phân tích axít béo
bằng GC.
+ Pha tĩnh ít phân cực:
- Cột SPB – 5 (30m x 0,32m x 0,25 µm).
- Chương trình nhiệt độ cột: Nhiệt độ đầu 40
0

0
C 1 phút.
- Buồng bơm: Nhiệt độ injector là 250
0
C, bơm chia dòng.
- Khí mang: Heli, tốc độ 1 ml/phút.
1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thông thường, khi phân tích các axít béo, người ta hay sử dụng phương
pháp GC. Tuy nhiên trong một số trường hợp đặc biệt, phương pháp HPLC
lại tỏ ra hữu dụng. Giá trị lớn nhất của HPLC là phân tích các axít dễ bay hơi
20

(các axít có mạch ngắn), hoặc dùng để nghiên cứu phương pháp đồng vị đánh
dấu các axít béo. Các đồng phân vị trí hay đồng phân cấu dạng khi tách bằng
HPLC cũng cho kết quả khả quan hơn GC. Khi tách bằng HPLC có thể sử
dụng nhiều loại detector khác nhau, nhưng đối với các phương pháp có tạo
dẫn xuất thì detector UV và detector huỳnh quang được dùng phổ biến hơn
cả. Ngày nay người ta cũng kết hợp detector khối phổ với HPLC để
cho kết
quả phân tích chính xác hơn [17]. Sau đây là các phương pháp tạo dẫn xuất
chính khi xác định axít béo bằng HPLC với detector UV và huỳnh quang.
a) Tạo dẫn xuất đo UV
Dẫn xuất hay dùng nhất để đo UV là este của phenacyl. Qui trình sử
dụng 4-bromphenacyl bromua như là thuốc thử tạo dẫn xuất.

Dung dịch 0,2 mM trimetyl amin trong axeton khan được sử dụng để
tạo môi trường kiềm; ngoài ra có thể dùng natri cacbonat hay kali hidroxit.
- Thuốc thử: 4-bromphenacyl bromua, ete 18-crown-6, KOH/metanol 50
mM. Axetonitrin.
- Qui trình:

thuốc thử tạo huỳnh quang. Phương pháp cho giới hạn phát hiện thấp 45 –
68 fmol đối với các axít béo từ C
14
– C
20
và còn thấp hơn đối với các axít
ngắn hơn. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là thuốc thử không có
trên thị trường mà phải tổng hợp trước khi phân tích.
Do đó trên thực tế, người ta hay sử dụng brommetylmetoxicoumarin
(Br-MMC) làm thuốc thử tạo huỳnh quang. Br-MMC có thể tạo ra hợp
chất phát huỳnh quang mạnh và nó cũng sẵn có trên thị trường.
22 J.H.Wolf và các cộng sự đã sử dụng qui trình sau đây để xác định các
axít béo tự do cũng như là các axít béo đã được axyl hóa cho kết quả rất tốt,
với giới hạn phát hiện ở mức ng [31].
- Hóa chất:
Dung dịch 1: 5 mg Br-MMC hòa tan trong 5 ml axetonitrin khan.
Dung dịch 2: 13 mg ete 18-crown-6 trong 5 ml axetonitrinkhan.
Lưu trữ các dung dịch này ở - 20
0
C.
Dung dịch làm việc: 40 µL dung dịch 1 và 2 µL dung dịch 2 được
cho vào 2 ml axetonitrin khan trước khi tạo dẫn xuất.
Kali cacbonat (khan).
- Qui trình:
Dẫn xuất hóa: 1- 2 µg axít béo và vài ng của chất nội chuẩn (C17:0)
được hòa tan trong một thể tích nhỏ của diclometan. Hỗn hợp sau đó được hút
bằng pipet vào ống nghiệm nhỏ. Sau khi làm bay hơi bằng khí nitơ, thêm 100