Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&THỰC PHẨM
HÓA SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:
CHIẾT, TINH CHẾ VÀ ỨNG DỤNG
CỦA ENZYME
Trang 1/98
GVHD:
LỚP:
NHÓM : 1
SVTH: LÊ THANH NGUYÊN 09248781
VŨ THỊ NINH 09248861
ĐOÀN THỊ PHƯỢNG 09247521
NGUYỄN THỊ THỦY 09246191
TẠ PHI VŨ 09258231
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.1Khái niệm về enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng
sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác.
Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng:
1- Làm tăng phản ứng hóa học.
2- Bản than chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng.
Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc tác hóa học chỉ làm tăng tốc độ phản
ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay
năng lượng sử dụng trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra
trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó gọi là enzyme.
Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấu men.
Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ
thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô

khác thì enzyme này được gọi là enzyme đa cấu tử hay còn gọi là enzyme phức tạp.
Các enzyme phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như ion kim loại,
vitamin, glutation dạng khử, … đa số enzyme có trong cơ thể thuộc enzyme đa cấu tử.
Trong thành phần enzyme đa cấu tử người ta phân biệt rõ các phần như sau:
- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme.
- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”.
Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzyme, có thể tồn tại độc lập.Trong khi tham gia
xúc tác, không phải toàn bộ tất cả các phần trong cấu trúc của enzyme tham gia mà chỉ có
một phần giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng. Phần giới hạn tham gia phản
ứng này được gọi là trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt đông của enzyme do một số axit
amin đảm trách. Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến thì không phải bất kỳ đột
Trang 3/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
biến nào cũng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản ứng sinh hóa của tế bào, chỉ có
những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axit amin
thì mới có ý nghĩa.
Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm
định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm này
có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng chúng lại gần nhau trong không gian.
Khoảng cách này được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình
xúc tác. Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động thường giống cấu trúc không gian
của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác.
Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử là nhóm ngoại và nhóm định chức của
axitamin nằm ở apoenzyme. Khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm định chức của
trung tâm hoạt động sẽ thay đổi cấu trúc không gian sao cho tương ứng với cấu trúc không
gian của cơ chất.
Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không có khả năng tham gia phản ứng ngay,
muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa. Trung tâm hoạt động của loại
enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay proenzym, ví
dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin. Các enzyme

bị mất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra khỏi thành phần của enzyme. Trong
trường hợp này enzyme này được gọi là metaloenzyme. Hoạt động của enzyme này sẽ
được phục hồi khi cho kim loại vào.
1.3Cách gọi tên và phân loại enzyme
Trước kia thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả. Các tên đã quen
dùng như tripxin, pepxin, kimotripxin, …hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thông dụng.
Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọi
Trang 5/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm
đuôi “aza”.
Tên gọi hệ thống thường gồm hai phần:
- Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi
của hai cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm);
- Chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác.
Ví dụ: + Tên thông dụng: ureaza
+ Tên gọi hệ thống: cacbamit – amidohydrolaza
Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hổ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ
hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc.
Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

L – axit amin
Có tên gọi: L – axit amin: oxydoreductaza (deamin)
Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã
thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1- 6. Các số thứ tự này là cố định
cho mỗi lớp:
1- Oxydoreductaza
2- Transpheraza
3- Hydolaza
4- Liaza

-
+ B  A + B
-
Các dạng thông dụng:
- Dehydrogenase: tách H
+.
Ví dụ: alcol dehydrogenase (1.1.1.1.), glutamate dehydrogenase
(1.4.3)
- Reductase: tác động khử
- Oxygenase: tác động oxy hóa
-
Peroxydase: tác động khi có H
2
O
2
, có tác dụng loại khả năng gây độc của H
2
O
2
trong cơ
thể.
1.3.2 Transferase
Có tác động lên phản ứng chuyển nhóm chức. Phương trình phản ứng tổng quát:
A – B + C  A + B – C
Các dạng thông dụng:
- Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A)
- Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose. Enzyme chuyển hóa tinh bột.
- Amino transferase: chuyển nhóm amin.
- Photpho transferase: ATP  ADP
Trang 7/98

oxaloacetic.
Trang 8/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
CHƯƠNG II: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME
1 Các phương pháp phá vỡ tế bào
1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học
Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được
hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật,
Trang 9/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay
mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác
bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong
thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải
được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay.
Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng
tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định.
- Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp
nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.
- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường
lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng.
Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra
khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế
bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần đây,
việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học
được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.
* Phương pháp đồng hóa áp lực cao:
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công
nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng
va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực

C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu
được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính
của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.
Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme). Có hai phương pháp hiện đang được sử
dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên
ngoài vào.
Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng
phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme
có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh,
Trang 11/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối
ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào. Tự
phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm
men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48
– 52
0
C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong
quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế
bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp
này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.
Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme từ
ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình
thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử dụng
hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật. Phương
pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều
kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp). Ngoài ra, người ta
còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.
2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành

kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố
rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.
2.2.2 Phương pháp lọc
Trang 13/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men,
người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme
ngoại bào hòa tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương
pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường
rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá
trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc;
sức đề kháng.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:
- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch
cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả.
- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và
trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay
được sử dụng nhiều hơn cả.
- Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất
enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch
lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc
và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình
lọc của vật liệu chất rắn.
- Lọc thông thường. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một số
nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những
phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.
2.3 Phương pháp cô đặc
Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối lớn
dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác

hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô
đặc là điều rất cần thiết.
Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:
- Bốc hơi lớp mỏng
- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng
- Bốc hơi ống dài
2.3.2 Phương pháp kết tủa
Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong
phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp
kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với
một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và
kết tủa dương.
- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ
không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết
tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.
* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao
quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.
Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết bị
dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép
không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ
thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay ammonium
sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại
không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 40
0
C, nhưng để tránh
khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và
Trang 16/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu của nồng

này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng
acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường
được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo
điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính
enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian
lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2.3.3 Phương pháp siêu lọc
Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ.
Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp
tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc,
thẩm thấu ngược.
Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh
khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược dùng
để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi đó, siêu
lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các
chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử dụng
cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly
propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng
lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta còn
tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.
2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme
2.4.1 Phương pháp kết tinh
Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết
tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất
cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến
2.4.2 Phương pháp điện di
Trang 18/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng
đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay

polyacrylamide
* Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký
Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 30
0
C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa
trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5)
(dung dịch đệm A). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô
được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem như dịch
enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH
4
)
2
SO
4
(25 – 60%). Phần kết tủa
thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong
20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì
sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A;
enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được lôi
cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn amylase.
Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose. Những
phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Trang 20/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn
với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp
sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 4
0

ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau đó ly tâm với
tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96% (cũng đã
được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 0
0
C
trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa bằng
acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể
tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-4
0
C. Ly tâm hốn
hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích acetone
lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4
0
C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.
Phương pháp hấp phụ
Trang 22/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay
betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau. Cách làm: cho kaolin khô
(hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml
dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được
gọi là bromelin-kaolin.
Phương pháp siêu lọc
- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách
các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích
thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích
thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và
những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng.

xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt
khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7
phút.
Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate
0,02M, pH 7,2. Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột.
Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút. Loại
bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme được thu đến khi dùng
Ba(NO
3
)
2
để thử (NH
4
)
2
SO
4
và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch
enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua sephadex
G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm
thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng
thời gian 1 giờ.
 Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký
Trang 24/98
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn
khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons.
Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành
phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có
hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 –