i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC .............................................................................................................. ........ i
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... ...ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... ..iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. ..iv
TÓM TẮT BẰNG TIẾNG ANH .................................................................................. ..v
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................. 3
5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 3
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1. Cây ngô và tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh ............................................... 4
1.1.1. Cây ngô ................................................................................................................. 4
1.1.2. Tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh ............................................................... 4
1.2. Vi khuẩn vùng rễ và vai trò đối với sự tăng trưởng của thực vật ............................ 7
1.2.1. Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ ................................................................................ 7
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với sự tăng trưởng của thực vật ....................... 8
1.2.3. Các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ ....................... 10
1.2.3.1. Cố định đạm .................................................................................................... 10
1.2.3.2. Hòa tan lân và các khoáng dinh dưỡng ............................................................ 12
1.2.3.3. Các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác ............................................... 14
1.3. Định danh vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật thông qua các phương
pháp Sinh học phân tử ................................................................................................... 15
Chương II. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17
2.1. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................................... 17
2.1.1. Vật liệu, hóa chất................................................................................................. 17
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ.................................................................................................. 18
2.2.8.4. Giải trình tự và lập cây phả hệ các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn ................... 39
Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 40
3.1. Một số chỉ tiêu lý hóa của đất vùng rễ cây ngô...................................................... 40
3.2. Mật số vi khuẩn cố định đạm/ hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô ................... 41
3.3. Mối quan hệ giữa các đặc tính dinh dưỡng của đất với mật số vi khuẩn đất vùng
rễ cây ngô ...................................................................................................................... 43
3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô ........... 47
3.5. Khả năng cố định đạm, hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô .. 55
3.5.1. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô ................... 57
3.5.2. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô ..................... 61
3.6. Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô đã
được tuyển chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA ...................................................... 65
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................... 72
i
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 73
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
1
Tên bảng
Bảng 1.1. Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô ở các tỉnh
thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010
38
7
8
9
Bảng 3.1: Nguồn gốc 10 mẫu đất vùng rễ cây ngô trồng trên đất xám
Tây Ninh
Bảng 3.2: Đặc tính dinh dưỡng đất vùng rễ cây ngô trồng trên đất
xám tỉnh Tây Ninh
Bảng 3.3: Mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân có
trong đất vùng rễ cây ngô trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
40
40
42
Bảng 3.4: Mối quan hệ giữa mật số vi khuẩn cố định đạm và hòa tan
10
phosphate trong đất vùng rễ cây ngô trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
44
với pH, N tổng số, P dễ tiêu và hàm lượng chất hữu cơ trong đất
57
16
Bảng 3.10: Lượng lân hòa tan của các dòng vi khuẩn thu được
61
Bảng 3.11: Nồng độ ammonium (NH4+), lân hữu dụng (P2O5) của 15
17
dòng vi khuẩn vùng rễ cây ngô trồng trên đất đất xám của tỉnh Tây
65
Ninh
18
Bảng 3.12: Tóm tắt nguồn gốc và mức độ đồng hình giữa 13 dòng
tuyển chọn với các chủng tương đồng có trong NCBI
68
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Hình 2.2. Sơ đồ pha loãng dịch đất và tạo hộp “đếm sống nhỏ giọt”
27
6
Hình 3.1: Xác định mật số tế bào vi khuẩn hòa tan lân
theo phương pháp “Đếm sống nhỏ giọt” trên môi NBRIP (TN6)
43
Hình 3.2: Đồ thị rải điểm và phương trình hồi quy đơn giữa mật số
7
vi khuẩn cố định đạm và hàm lượng lân dễ tiêu trong vùng rễ cây
45
ngô trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
Hình 3.3: Đồ thị rải điểm và phương trình hồi quy đơn giữa mật số
8
vi khuẩn cố định đạm và hàm lượng đạm tổng số trong vùng rễ cây
46
ngô trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
9
10
11
60
61
63
64
66
Hình 3.13: Cây phả hệ cho thấy vị trí tương đối của các PGPR được
18
xây dựng dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp
67
neighbor-joining
Hình 3.14: Cây phả hệ của 13 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô
19
được xây dựng dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp
neighbor-joining
69
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
v
TÓM TẮT BẰ/NG TIẾNG ANH
Rhizobacterial diversity and population dynamics in the Acrisol rhizosphere of maize
grown in Tay Ninh province were studied. Rhizosphere soil samples were taken from
seven districts of this province. Physical and chemical characteristics of soil samples
were analysed. Total nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria counts were
determined by drop plate counts method together with 16S rRNA gene fragments
amplified from their DNA using eubacterial universal primers (8F and 1492R). A
total of 79 isolates were isolated from two media (Burk’s N-free and NBRIP) and 55
of them have the ability of nitrogen fixation and phosphate solubilization. The
population of nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria correlated with soil
pH and organic matter content in soil closely (P
khả năng hòa tan lân, hay bổ sung thêm các dòng có các đặc tính khác như hòa tan
kali, tổng hợp IAA… Vì vậy, nếu phát hiện được một dòng cùng lúc có hai hoặc
ba khả năng vừa nêu thì đó sẽ là nguồn giống vô cùng quý giá.
Với những lý do vừa nêu, hướng nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô (Zea mays L.) trồng
trên đất xám tỉnh Tây Ninh” là có tiềm năng thực hiện. Vi sinh vật được phân
lập từ cây trồng và vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất,
thân thiện với môi trường và có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây
trồng và vùng đất đó. Đất xám vốn là loại đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp nên
lượng phân hóa học dùng trong canh tác thường nhiều hơn. Thế nhưng trong một
môi trường ít màu mỡ như vậy, để thích nghi, có thể thực vật ở đây có được mối
quan hệ gắn bó với các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một cách hiệu quả các
chất dinh dưỡng. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, đất xám được chọn làm môi
trường để dò tìm các dòng vi khuẩn đất vùng rễ có các đặc tính quý vừa nêu. Các
dòng vi khuẩn phát hiện được có thể là nguồn giống cho việc nghiên cứu sản xuất
chế phẩm phân bón vi sinh chuyên dụng cho cây ngô và đạt hiệu quả trên các loại
đất nghèo dinh dưỡng như đất xám. Điều này sẽ mang lại lợi ích kinh tế cho nhà
nông và người tiêu dùng, đồng thời cũng góp phần bảo vệ tài nguyên nông nghiệp
được phát triển an toàn và bền vững.
2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn được những vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân trong đất
vùng rễ cây ngô để có thể sử dụng như là nguồn phân vi sinh nhằm thay thế hay
tiết kiệm một lượng phân khoáng NPK trong nhu cầu dinh dưỡng của cây ngô.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu bao gồm các vi khuẩn trong đất vùng rễ cây ngô thuộc các
giống ngô lai được trồng phổ biến trên đất xám tỉnh Tây Ninh.
3
được dùng làm lương thực, thực phẩm nuôi sống khoảng 1/3 dân số thế giới. Tất
cả các bộ phận của cây ngô từ hạt, thân, lá đều có công dụng. Theo Nguyễn Đức
Cường (2010), từ cây ngô có thể chế biến tạo thành trên 670 sản phẩm chính và
các sản phẩm phụ. Có đến 70% tổng sản lượng ngô trên thế giới được dùng làm
thức ăn cho gia súc dưới dạng thức ăn tươi hoặc ủ chua. Khoảng 20% tổng sản
lượng ngô trên thế giới được dùng trong sản xuất công nghiệp (Dương Minh,
1999).
1.1.2. Tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh
Tây Ninh là một trong sáu tỉnh của miền Đông Nam Bộ, có tọa độ từ
10o57’08’’ đến 11o46’36’’ vĩ độ Bắc và từ 105o48’43” đến 106o22’48’’ kinh độ
Đông. Phía Tây và Tây Bắc giáp vương quốc Cambodia; phía Đông giáp tỉnh Bình
Dương, Bình Phước; phía Nam giáp Tp. Hồ Chí Minh và tỉnh Long An (Hình 1.1).
Khí hậu trong vùng nóng ẩm, ôn hòa quanh năm. Nhiệt độ trung bình năm là
27,4oC. Lượng mưa trong năm đạt 1.578,7 mm. Một năm có hai mùa rõ rệt: mùa
khô kéo dài từ tháng 12 đến tháng 4, và mùa mưa từ bắt đầu từ tháng 5 đến tháng
11 năm sau ( />1/7/2014).
Đất xám (Acrisols) là loại đất có diện tích lớn đứng hàng thứ hai, chiếm gần
32% tổng diện tích tự nhiên của vùng Đông Nam Bộ. Đất xám phân bố rải rác
khắp sáu tỉnh thành của vùng, trong đó có sự tập trung nhiều ở tỉnh Tây Ninh (tiểu
5
vùng đất xám bạc màu Tây Ninh). Đất xám có tính chua, thành phần cơ giới nhẹ,
khả năng giữ nước kém, độ bền đoàn lạp thấp, hàm lượng mùn thấp, khả năng trao
đổi cation (CEC) rất thấp, nghèo dinh dưỡng (Lê Huy Bá, 2009). Đất xám cũng
được khuyến nghị cho canh tác nông, lâm nghiệp nhưng cần chú ý đầu tư phân bón
để đạt năng suất cao.
Hình 1.1: Bản đồ hành chính tỉnh Tây Ninh
(nghìn tấn)
Bình Phước
6,7
31,9
21,4
Tây Ninh
5,8
50,7
29,4
Bình Dương
0,6
20,0
1,2
Đồng Nai
47,7
1.2. Vi khuẩn vùng rễ và vai trò đối với sự tăng trưởng của thực vật
1.2.1. Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ hay hệ rễ (rhizosphere) được biết đến như là một lớp đất mỏng bao
quanh rễ cây. Đó là một khu vực cực kỳ quan trọng và tích cực cho hoạt động của
rễ và sự trao đổi chất. Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner
(1904) để mô tả một vùng hẹp của đất xung quanh rễ nơi mà các quần thể vi sinh
vật được kích thích bởi hoạt động của rễ (Hartmann et al., 2008). Khái niệm ban
đầu này đã được mở rộng, bao gồm vùng đất xung quanh rễ nơi mà các đặc tính
vật lý, hóa học và sinh học đã được thay đổi bởi sự phát triển và hoạt động của rễ
(McCully, 2005 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011). Tùy thuộc vào hoạt động
đang xét như là sự tiết các hợp chất cảm ứng, hoạt động hô hấp hay sự hấp thụ
nước và các dưỡng chất di động mà phạm vi của vùng rễ có thể dao động từ dưới
đơn vị µm cho đến trên cm (Hinsinger et al., 2005). Lớp đất bao quanh rễ thường
được kết dính bởi mạng sợi của nấm rễ, hệ thống lông hút, các chất nhày do rễ và
các vi sinh vật vùng rễ tiết ra tạo nên một cấu trúc gọi là vỏ rễ (rhizosheath) (Hình
1.2) (Watt et al., 1993; Hinsinger et al., 2009).
Hình 1.2: Vỏ rễ hình thành quanh rễ cây Lyginia barbata
(Nguồn: Hinsinger et al., 2009)
8
Trong các vi sinh vật hiện diện ở vùng rễ, vi khuẩn là nhóm phong phú nhất.
Do đó chúng có ảnh hưởng lớn đến sinh lý học thực vật và có khả năng cạnh tranh
cao trong tiến trình dòng hóa rễ (Saharan and Nehra, 2011). Sau khi tập trung ở
vùng rễ (rhizophere), chúng di chuyển đến bề mặt rễ (rhizoplane) và tại đó thể hiện
các lợi ích đối với cây chủ. Một số chủng, loài còn có khả năng xâm nhập vào rễ
(endorhizophere), thậm chí là vào các bộ phận khác của cây (Compant et al.,
quá trình này; tuy nhiên, chỉ có một số ít gene được xác định (Benizri et al., 2001;
Lugtenberg et al., 2001). Chúng bao gồm gene chi phối các khả năng di động, sản
phẩm của tiêm mao hay roi, khả năng sản sinh những chất đặc biệt trên bề mặt rễ
cây, khả năng sản sinh các chất cảm ứng (Lutenberg et al., 2001). Sự nghèo nàn về
mật số của PGPR trong đất vùng rễ xảy ra khi mà trong quá trình phát triển của
thực vật gặp phải các điều kiện bất lợi như pH thấp, nhiệt độ cao, lượng mưa thấp
(Frommel et al., 1993). Đối với cây trồng, những điều kiện canh tác không mong
muốn cũng là nguyên nhân làm giảm mật số vi sinh vật trong đất (Dobbelaere et
al., 2001). Sự khác biệt về nhiệt độ cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
phát triển của PGPR (Okon and Labandera-Gonzalez, 1994).
ISR: Induction of Systemic Resistance of host plant by PGPR
Hình 1.3: Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng thực vật bởi PGPR
(Nguồn: Kumar et al., 2011)
10
Vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự phát triển của cây trồng thông qua các cơ chế
gián tiếp và trực tiếp nhưng cơ chế chuyên biệt vẫn chưa được hiểu rõ (Glick,
1995; Kloepper, 1993). PGPR kích thích trực tiếp sự phát triển của thực vật thông
qua sự cố định đạm, hòa tan lân khó tan, phân giải kali, sản sinh chất điều hòa sinh
trưởng, v.v… (Glick, 1995; Qi-mei et al., 2002; Zhao et al., 2008). Cơ chế tăng
trưởng của thực vật trực tiếp thông qua việc hấp thụ kim loại và các ion trên bề
mặt rễ cây cũng đã được báo cáo (Bashan and Levanony., 1991; Bertrand et al.,
2000). PGPR tác động tốt đến cây trồng một cách gián tiếp, thông qua sự khống
chế các vi sinh vật gây bệnh. Các cơ chế có thể kể đến là cạnh tranh dinh dưỡng,
cạnh tranh các nguyên tố kẽm, sắt với vi sinh vật gây bệnh; tổng hợp các chất
kháng khuẩn; tiết enzyme phân hủy màng tế bào nấm; sản sinh hydrogen cyanide
khống chế nấm gây hại; v.v... (Hình 1.3) (Glick, 1993; Persello-Cartieaux et al.,
vời hơn vì giúp mở rộng khả năng huy động nguồn đạm vô tận từ không khí (N2)
cho nhiều loại cây trồng khác nhau. Hạn chế chính mà các vi khuẩn không cộng
sinh phải đối mặt là nhu cầu cao về nguồn carbon và nguồn năng lượng sẵn có cho
một quá trình tốn kém năng lượng như cố định đạm. Hạn chế này có thể được khắc
phục bằng cách di chuyển đến gần thực vật, chẳng hạn như các vi khuẩn
diazotrophe trong vùng rễ hoặc trên bề mặt rễ và các vi khuẩn nội sinh.
Azotobacter và Azomonas là hai chi thuộc họ Azotobacteriaceae. Việc chủng
Azotobacter có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm và phát triển của cây con
Helianthus annus (Shaukat et al., 2006). Các cây trồng khác nhau ở Ấn Độ đã
được chủng với Azotobacter và Azospirillum và cho thấy tác dụng cải thiện năng
suất trên cả cây cỏ hàng năm và lâu năm (Saharan and Nehra, 2011).
Kể từ năm 1970, các dòng Azospirillum đã được phân lập và sử dụng. Mặc dù
Azospirillum lần đầu tiên được phân lập là từ ngũ cốc và hầu hết sự chủng trở lại
được thực hiện trên các loại cây trồng ngũ cốc, tuy vậy có nhiều loài khác ngũ cốc
được chủng thành công với Azospirillum. Các loài Azospirillum cố định đạm trong
điều kiện vi hiếu khí. Sau khi dòng hóa trong vùng rễ, Azospirillum thường thúc
đẩy sự phát triển của thực vật. Mặc dù sở hữu khả năng cố định N2 (khoảng 1 10kg N/ha) nhưng sự gia tăng sản lượng bởi Azospirillum chủ yếu là do sự sản
xuất các chất thúc đẩy tăng trưởng thực vật, từ đó cải thiện phát triển hệ rễ làm
tăng tỉ lệ hấp thu nước và khoáng (Saharan and Nehra, 2011). Acetobacter đã đạt
được tầm quan trọng như là một chế phẩm cho cây mía. Vi khuẩn này dòng hóa
thành công vào các giống mía ở Ấn Độ, nơi thay thế phân đạm hoá học hoàn toàn
12
bằng phân hữu cơ ít nhất là trong hai năm liên tiếp (Gillis et al., 1989;
Muthukumarasamy et al., 2000; Ashbolt and Inkerman, 1990 trích dẫn của Saharan
and Nehra, 2011). Azoarcus là một vi khuẩn nội sinh, vi hiếu khí và có khả năng
cố định đạm cực kỳ hiệu quả. Vi khuẩn này được phân lập từ cỏ Kallar
(Leptochloa fusca L. Kunth) và có thể gây nhiễm vào rễ lúa. Ở Pakistan- nơi mà
trên quy mô toàn cầu để khai thác tiềm năng của nhóm Pseudomonad huỳnh quang
(Fluorescent Pseudomonads - FLPs). FLPs giúp đỡ trong việc duy trì sức khỏe đất,
là nhóm đa dạng nhất về mặt trao đổi chất và chức năng. Các Pseudomonad nhanh
chóng xâm chiếm rễ của khoai tây, củ cải đường và củ cải, và làm gia tăng sản
lượng đáng kể về mặt thống kê lên đến 144% trong các thử nghiệm thực địa
(Saharan and Nehra, 2011). Các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. và Azospirillum
sp. phân lập được từ đất vùng rễ và rễ của Piper nigrum L. thể hiện khả năng hòa
tan phosphate in vitro cao (Ramachandran et al., 2007).
Khoảng 95% trực khuẩn đất Gram dương thuộc chi về chi Bacillus. Các
thành viên của các loài vi khuẩn Bacillus có thể tạo nội bào tử do đó có thể tồn tại
trong điều kiện bất lợi của môi trường. Bacillus megaterium cũng giúp cải thiện
các hiệu suất rễ, chiều dài và hàm lượng chất khô của rễ bạc hà (Kaymak et al.,
2008). Natarajan và Subramainan (1995) cho rằng chủng kết hợp Rhizobium
(chủng Tt 9) với B. megaterium var. phosphaticum có thể đáp ứng với khoảng 50%
nhu cầu phân bón có chứa phosphate của đậu phộng; làm gia tăng nốt rễ, tăng
chiều dài rễ và chồi cũng như tăng năng suất quả (trích dẫn của Kumar et al.,
2011). Nghiên cứu in vitro cho thấy chủng phối hợp Azotobacter vinelandii và
Bacillus cereus làm gia tăng khả năng hòa tan phosphate (Husen, 2003 trích dẫn
của Saharan and Nehra, 2011). Một nghiên cứu của Algawadi và Gaur (1988)
trong điều kiện nhà kính nhằm tìm hiểu hiệu quả của việc chủng phối hợp
Rhizobium và vi khuẩn hòa tan phosphate bao gồm Pseudomonas striata hoặc
Bacillus polymyxa lên sản lượng và hàm lượng dinh dưỡng của đậu xanh với sự bổ
sung hoặc không bổ sung phân bón (Kumar et al., 2011).
Với các nguyên tố đa lượng khác, các vi khuẩn vùng rễ cũng góp phần quan
trọng trong việc chuyển hóa các dạng khó hấp thu trong đất thành dạng sẵn có cho
cây trồng. Việc chủng các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (Thiobacillus) vào hạt
giống của những cây trồng có nhu cầu về S cao đã được chứng minh là khá thành
công trong việc tạo ra dạng lưu huỳnh hữu dụng hơn cho cây (Saharan and Nehra,
2011). Ngoài ra, nhiều loài vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có khả năng
của cây chủ từ đó làm giảm hoạt tính sinh khả dụng của kim loại nặng trong đất
(Saharan and Nehra, 2011). Vì đặc tính này, các PGPR chịu/kháng kim loại nặng
15
có thể được sử dụng như tác nhân chữa trị sinh học (bioremediation) tiềm năng cho
đất bị ô nhiễm (Chacko et al., 2009).
1.3. Định danh vi khuẩn thông qua các phương pháp Sinh học phân tử
Các phương pháp phân loại và định danh truyền thống được thực hiện dựa
trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, dinh dưỡng và phát triển của sinh
vật. Các tài liệu tham khảo chuẩn hỗ trợ cho các phương pháp này có thể kể đến
như Vi khuẩn học hệ thống của Bergey (Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology) hay Vi khuẩn học lâm sàng (Manual of Clinical Microbiology). Tuy
nhiên các phương pháp truyền thống này không thể áp dụng cho các sinh vật
không thể nuôi cấy, chẳng hạn như Tropheryma whippelii. Hoặc trong một vài
trường hợp, đặc tính sinh hóa của một số sinh vật không phù hợp với mô hình với
bất kỳ chi, loài nào đã biết (Woo et al., 2000). Với sự phát hiện phản ứng chuỗi
trùng hợp (PCR) và phương pháp giải trình tự DNA, sự xác định các đơn vị phân
loại (taxon) nào có liên quan chặt chẽ với nhau đã được thực hiện thành công hơn
so với phương pháp thông thường khác. PCR (Polymerase Chain Reation) là kỹ
thuật Sinh học phân tử cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA mong muốn từ
DNA bộ gen của một cơ thể sinh vật với sự có mặt của cặp mồi đặc hiệu. Kỹ thuật
này được Kary Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985; mặc dù nguyên tắc đã được
mô tả trước đó một thập niên bởi Khorana và cộng sự. Phương pháp PCR cho phép
khuếch đại rất nhanh một trình tự chuyên biệt. Đây là phương pháp hiện đại và
thuận tiện cho sự xác định sự hiện diện của một trình tự nào đó trong mẫu với độ
chính xác cao và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (Trần Nhân Dũng và
ctv., 2012).
Công dụng và sự thuận tiện của các phương pháp khuếch đại trên nền tảng
Chương II
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nghiên cứu của đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và
Sinh hóa, trường Đại học Sài Gòn và Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và Sinh học
Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- Mười mẫu đất vùng rễ cây ngô lai F1 trong giai đoạn trổ cờ được thu tại 7 huyện
của Tây Ninh vào tháng 7/2013.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- pH kế Mettle MP220
- Máy lắc Red Roter
- Cân phân tích Sartorius BP210S
- Tủ cấy Esco
- Tủ sấy Binder ED115
- Tủ Hotte
- Bếp vô cơ hóa Foss
- Máy phân tích đạm tự động Kjeltec 2300
- Tủ mát Akira
- Tủ lạnh âm sâu Akira URF 180
- Nồi hấp tiệt trùng nhiệt ướt Tomy ES-315
- Quang phổ kế Labomed
- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C
- Máy hút chân không Eppendorf Concentrator 5301
Copyright: Tài liệu đại học ©