Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus spp. CÓ KHẢ
NĂNG SINH PROTEASE VÀ AMYLASE TỪ CHAO
PGS.Ts. Ngô Thị Phương Dung Lâm Trí Đức

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
Cần Thơ, ngày tháng năm
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký tên)

Cảm ơn các anh chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực phẩm, Viện
Ngiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.
Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khoá 35 cùng các em
sinh viên K36, K37 đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Xin kính chúc ba mẹ, quý thầy cô, các anh chị dồi dào sức khoẻ! Chúc tất cả các
bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến K35 báo cáo luận văn thành công tốt đẹp.
Người thực hiện
Lâm Trí Đức Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng sinh protease và
amylase từ chao nhằm sưu tầm và chọn lọc các chủng vi sinh vật có triển vọng hướng
tới sản xuất chế phẩm sinh học. Kết quả có 20 dòng vi khuẩn được phân lập từ 10 loại
chao được thu mua tại các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Cả 20 dòng vi khuẩn

MỤC LỤC i
DANH SÁCH BẢNG iii
DANH SÁCH HÌNH iv
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus spp. 3
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 4
2.2.1. Enzyme protease 4
2.2.2. Enzyme amylase 5
2.3. Giới thiệu về các sản phẩm lên men đậu nành bởi vi khuẩn Bacillus subtilis. 6
2.4. Tình hình nghiên cứu về Bacillus trong và ngoài nước 6
2.4.1. Trong nước 6
2.4.2. Ngoài nước 7
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 9
3.1. Phương tiện nghiên cứu 9
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 9
3.1.2. Vật liệu 9
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ 9
3.1.4. Hóa chất và môi trường 9
3.2. Phương pháp nghiên cứu 10
3.2.1. Thu thập mẫu 10
3.2.2. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ sản phẩm lên men đậu nành 10
3.2.3. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phân lập 12
a. Xác định hoạt tính catalase 12
b. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 12
c. Nhuộm Gram 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


i
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Nghiệm thức các nguồn carbon khác nhau……………………… …17
Bảng 2. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được từ các loại chao khác nhau 20
Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập được. 21
Bảng 4. Đặc điểm tế bào của các vi khuẩn đã phân lập 21
Bảng 5. Đặc điểm sinh hoá của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập 26
Bảng 6. Đường kính vòng tròn thuỷ phân của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp.
trên môi trường nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột. 28
Bảng 7. Đường kính vòng tròn thuỷ phân của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp.
trên môi trường skim milk agar. 29
Bảng 8. Độ hấp thụ OD của vi khuẩn Bacillus spp. ở 660 nm trong các
nguồn carbon 30
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

1
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, đối tượng vi sinh vật đang được tập trung nghiên cứu nhằm phân lập
và tuyển chọn để phục vụ cho sản xuất và đời sống con người ví dụ như phân lập các
dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân, tổng hợp đạm, tổng hợp các chất kích thích
sinh trưởng. Sử dụng các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cao để ứng
dụng trong lên men thực phẩm. Đồng thời vi sinh vật còn được sử dụng trong dược
phẩm, xử lý môi trường và đặc biệt là trong công nghiệp.
Ngoài ra, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học k
thuật đã làm cho cuộc sống của con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống
tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi
hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu
cầu phù hợp với người tiêu dùng. Với mục đích tăng năng suất chất lượng sản phẩm
chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm
bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh
trong chăn nuôi, sử dụng vi sinh vật có lợi là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục
đích này.
Một trong những dòng vi khuẩn đã được nghiên cứu và được ứng dụng rộng rãi
đó là vi khuẩn Bacillus. Theo Perez et al. (2003), Bacillus là vi khuẩn Gram dương, có
dạng hình que, có khả năng sinh bào tử và đặc biệt là có khả năng tổng hợp được
enzyme có hoạt tính rất cao đặc biệt là amylase và protease. Nhiều chủng Bacillus có
khả năng sản xuất protease nội bào và ngoại bào. Priest (1977) đã chứng minh vi
khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp và sản xuất protease, esterase và một số

1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập những dòng vi khuẩn Bacillus spp.
từ chao qua đó tuyển chọn những dòng Bacillus spp. có khả năng tổng hợp enzyme
amylase và protease cao.
Để thực hiện mục tiêu này, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
- Phân lập những dòng vi khuẩn Bacillus spp. từ chao.
- Chọn lọc những dòng vi khuẩn Bacillus spp. khả năng tổng hợp enzyme
protease và amylase.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

3
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus spp.
Theo Perez et al., (2003), Bacillus là trực khuẩn Gram dương, catalase dương
tính, hiếu khí, có khả năng di động nhờ lông roi, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên trong
đất, nước, không khí và các chất hữu cơ thối rữa. Là vi khuẩn có nội bào tử có khả
năng chịu nhiệt cao, sinh trưởng hiếu khí hoàn toàn hoặc hiếu khí không bắt buộc.
Chính vì Bacillus thường xuyên có mặt trong đất mà Winogradsky đã gọi chúng là vi
khuẩn của đất. Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người tất cả các Bacillus
được coi là không độc hại cho người (Oliver, 2009). Đặc biệt Bacillus subtilis từ lâu
được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme và sử dụng cả tế bào sống trong nhiều quá
trình sản xuất và chế biến thực phẩm như một vi sinh vật an toàn.
Vị trí phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (2
nd

carbonhydrate thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và butanediol.
Bacillus mọc tốt trên môi trường có nguồn carbon duy nhất là đường, acid hữu cơ,
rượu,… với nguồn nitơ duy nhất là ammonium. Ngoài ra, có một số dạng phân lập cần
vitamin để tăng trưởng. Chúng có thể sử dụng các sản phẩm enzyme thuỷ giải ngoại
bào do quá trình phân giải polysaccharide, acid nucleic và lipid làm nguồn carbon và
chất cho điện tử (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978).
Việc phân loại theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằng việc giải trình tự
gen 16S rDNA. Theo phương pháp này người ta đã tìm ra các Bacillus có mối quan hệ
họ hàng với một số loài vi khuẩn không hình thành nội bào tử như Enterococcus,
Latobacillus và Streptococus ở cấp độ phân loại bộ và Listeria và Staphylococus ở cấp
độ phân loại họ (Torsten Stein et al., 2005).
Hầu hết các vi khuẩn thuộc giống Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu
khí. Khi xử lý mẫu bằng nhiệt độ, các tế bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ phá huỷ,
trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn sống (Nguyễn Đình Bảng et al., 1992).
Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau làm
cho nó có khả năng phân giải các chất hữu cơ tự nhiên khác nhau có nguồn gốc từ thực
vật, động vật bao gồm: cellulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon và nhiều
loại khác, sản xuất chất kháng sinh, nitrat hoá, khử nito, cố định nito, là sinh vật tự
dưỡng, chịu acid, chịu kiềm, chịu nhiệt,…. (Oncharoen et al., 2002).
Bacillus subtilis là vi khuẩn có tiềm năng cao để sản xuất protease, bởi vì nó không
chứa độc tố. Các protease được úng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau. Các
chủng khác sản xuất các độc tố côn trùng, sâu bọ để bảo vệ mùa màng, sản xuất kháng
sinh và kháng nấm (Slepecky, R.A và H.E.Hemphill., 2006)
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.2.1. Enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở
trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào).
Hiện nay, protease ngoại bào đươc chú trong nghiên cứu nhiều hơn so với protease nội
bào. Một số loại protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử
dụng rộng rãi trong nhiều ngành công, nông nghiệp.

trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Dựa theo tính chất và phương
pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biết α-amylase, glucose-amylase, oligo-1,6-
glucoxydase. Vi khuẩn tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm mốc, nấm men và
vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis được nghiên cứu
và sử dụng rộng rãi nhất.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

6
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan nhau: quá trình tổng
hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi
trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở giai đoạn vi khuẩn đã hoặc
đang kết thúc quá trình sinh trưởng.
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: công nghiệp rượu bia, công nghiệp nước chấm, sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ
tiêu hoá tinh bột, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi.
2.3. Giới thiệu về các sản phẩm lên men đậu nành bởi vi khuẩn Bacillus subtilis
Natto là sản phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản được ra đời cách nay ít
nhất 1.000 năm và hơn 3.000 tấn Natto sản xuất hàng năm, vi khuẩn được sử dụng để
len men Natto là Bacillus subtilis natto (Sumi, 1997).
Thua nao là sản phẩm len men đậu nành rất nổi tiếng ở Thái Lan, đậu nành được
rửa, ngâm qua đêm sau đó được nấu từ 3 đến 4 giờ rồi dùng lá chuối gói lại, sau đó
cho lên men tự nhiên từ 2 đến 3 ngày ở nhiệt độ môi trường, ngoài ra có thể cho lên
men trong tự nhiên dưới ánh nắng trực tiếp của mặt trời giúp sản phẩm khô và trữ
được lâu hơn (Sundhagul et al., 1999). Từ sản phẩm lên men Thua nao đã có rất nhiều
chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính enzyme cao được phân lập (Panuwan
Chantawannakul et al., 2002). Yasuhiro et al. (2003) đã phân lập được 90 dòng vi
khuẩn Bacillus từ 36 sản phẩm lên men đậu nành thu từ các nước Châu Á.
2.4. Tình hình nghiên cứu về Bacillus trong và ngoài nước

xuất chế phẩm Bacillus subtilis.
Nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh như Bacillus subtilis làm sạch môi trường
nhờ khả năng tổng hợp ra các enzyme (protease, amylase, cellulase, chitinase, lipase)
phân huỷ các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật
gây bệnh, do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng
thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim, 2007).
Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã được sử dụng rộng rãi trong sản xuất
kháng sinh, enzyme, trong bảo quản thực phẩm,… do chúng có khả năng sản xuất ra
các chất có hoạt tính kháng sinh như bacitracin, Bacillo peptin, Iturin A, Surfactin,
Plipastatin A và B,… (Lê Thị Loan et al., 2005).
2.4.2. Ngoài nước
Vi khuẩn thuộc giống Bacillus đã được nhiều nhà khoa học quan tâm chú ý đánh
giá cao. Ở phương Tây đã sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis dùng trong
bột giặt, sản xuất α-amylase biến tinh bột thành sirô bắp giàu fructose. Ngoài ra, các vi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

8
khuẩn Bacillus còn là nguồn cung cấp nhiều loại kháng sinh, các chất làm tăng hương
vị như purin nucleoside, surfactan,… với các đặc tính này cùng với khả năng tạo bào
tử và nẩy mầm đã làm Bacillus trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn
Gram dương (Lê Thị Lan, 1997; Priest, 1993).
Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với số lượng lớn, có tính bền vững,
hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công
nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc
(fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), làm nước mắm từ cá (Rebeca et al.,
1991), làm thức ăn gia súc (Cheng et al., 1995),…
Ngoài ra, một trong những thuận lợi quan trọng nhất trong việc sử dụng vi khuẩn
Bacillus subtilis đó là chúng gần như không dùng gen để kháng lại kháng sinh hay độc

3.1.2. Vật liệu
Nguồn mẫu dùng để phân lập: sản phẩm lên men từ đậu nành là chao thuộc
nhiều chợ khác nhau trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Đĩa Petri, eppendorf 1,5ml, thanh kim loại (d=6mm)
- Tủ lắc ủ (incubator shaker) Innova 4200, New Brunskick Scientific, USA.
- Tủ ủ (incubator) Sanyo, MTR - 162
- Tủ cấy Telstar, model AV - 100
- Kính hiển vi quang học Olympus DP12 BX41
- Nồi khử trùng pbi international 22793
- Tủ lạnh Sanaky Tokyo, Japan
- Eppendorf centrifuge 5417R.
3.1.4. Hóa chất và môi trường
- NA (nutrian agar), NA broth, yeast extract, beef extract, peptone, glucose, natri
acetate, CaCO
3
.
- Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, dung dịch iod, dung dịch khử màu
(ethanol và aceton theo tỷ lệ 1:1), fushin. Hóa chất nhuộm bào tử: dung dịch xanh
methylen 1% và đỏ trung tính 0,5%. Thuốc thử catalase H
2
O
2
3%, thuốc thử oxidase
(sản phẩm của công ty Nam Khoa Biotek) và thuốc thử indole.
Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme amylase: Tinh bột 0,1%; NaCl 0,1%; dung
dịch iod 0,02N.
Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme protease: Gelatin.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ


pha loãng cuối cùng (10
5
) và cấy lên đĩa petri có chứa môi trường Nutrient agar (NA)
(1% peptone, 0,5% beef extract, 0,5% NaCl và 1,5% agar). Ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong 24
giờ.
Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng sữa, độ
nổi mô, phẳng hoặc lài, bìa chia thùy hoặc răng cưa. Khuẩn lạc phân lập nằm trên
đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

11
Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan
sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô
trùng, đặt trên miếng lame đã khử trùng bằng cồn 96% thực hiện quan sát mẫu dưới
kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100. Những dòng vi khuẩn được chọn là các dòng
hình que và di động được.
Các dòng vi khuẩn phân lập được trữ trên môi trường NA ở 40
o
C. Quy trình phân
lập được trình bày tóm tắt ở Hình 3.

Giữ giống trên môi trường
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

12
3.2.3. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phân lập
Các dòng vi khuẩn phân lập sẽ được kiểm tra các đặc tính sinh hoá của Bacillus theo
khoá luận của Bergey (Sneath, 1986; Holt et al., 1994; Yasuhiro Inatsu et al., 2002;
Sharmin và Rahman, 2007).
a. Xác định hoạt tính catalase
Sử dụng que cấy lấy một ít sinh khối từ các khuẩn lạc rời rạc rồi chấm vào giọt
dung dịch H
2
O
2
30%, nếu có hiện tượng sủi bọt khí thì có hiện tượng catalase dương.
Do vi khuẩn Bacillus sp. có enzyme KatA và MrgA có khả năng phân huỷ hydrogen
peroxise thành nước và oxy trong phản ứng catalase (Bandow et al., 2002). Tuỳ theo
đặc tính của vi khuẩn mà có hiện tượng sủi bọt khí mạnh hay yếu, nếu không có hiện
tượng sủi bọt khí thì kết quả catalase âm tính.
Vi khuẩn Bacillus sp. sẽ cho kết quả catalase (+).
b. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Quan sát hình dạng của vi khuẫn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi
khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng
phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.

C, sau đó lấy một ít sinh khối để nhuộm Gram. Quy
trình thực hiện như sau:
 Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên giữa kính mang vật.
 Dùng que cấy đã khữ trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít sinh khối vi
khuẩn rồi trải mỏng vi sinh vật lên kính mang vât.
 Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên
kính mang vật.
 Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi
sinh vật đã cố định, trải đều Crystal Violet bằng que cấy và để hai phút.
 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
 Nhỏ từ một đến hai giọt dung dich Iod rồi trải đều bằng que cấy và để
trong một phút.
 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
 Rửa lại bằng cồn 70
0
thật nhanh để tẩy màu từ đầu tới cuối kính mang vật
sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím.
 Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô nước.
 Nhỏ từ một đến hai giọt Fuchsin rồi trải đều bằng que cấy và để trong một
phút.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

14
 Rửa lại bằng nước cât vô trùng cho đến khi giọt nước cuối cùng không
còn màu của Fuchsin.
 Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Quan sát mẫu vật trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận
Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal Violet là mẫu

15
 Nhuộm mẫu bằng dung dịch đỏ trung tính 0,5%, trong 1 phút
 Rửa lại bằng nước cất, để khô
Kết quả: Quan sát mẫu dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100)
Bào tử : bắt màu xanh
Không có bào tử: bắt màu đỏ
Vi khuẩn Bacillus sp. có nội bào tử bắt màu xanh.
3.2.4. Tuyển chọn Bacillus spp. có khả năng sinh enzyme protease và amylase cao
Ly trích enzyme thô
Các dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập được, sẽ được nuôi trong môi trường
Nutrient broth, lắc 150 vòng/phút ở 37
o
C trong 24 giờ. Ly tâm dưới tốc độ 13.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4
o
C. Thu lấy 50 µL dung dịch ở lớp trên để được dung dịch
enzyme thô.
Xác định hoạt tính amylase của các dng Bacillus spp. phân lp đưc
Hoạt tính amylase được xác định theo phương pháp của Sharmin và Rahman
(2007) và Helga et al. (2005).
Hoạt tính amylase thuỷ phân tinh bột được xác định trên môi trường Nutrient
agar có bổ sung dung dịch hồ tinh bột. Cân 10 mg tinh bột trong 100 mL nước cất đun
cách thuỷ cho đến khi tan hoàn toàn. Hút 20 mL hồ tinh bột sẽ được trộn với 100 mL
môi trường Nutrient agar sau đó trộn đều và đem khử trùng sau đó phân phối vào các
đĩa petri.
Dùng thanh kim loại vô trùng tạo thành các giếng có đường kính bằng nhau trên
bề mặt thạch (0,6 cm), mỗi đĩa 4 giếng.
Hút 30 µL dung dịch enzyme thô cho vào từng giếng, mỗi đĩa 3 giếng được cho
dịch trích enzyme thô vào và một giếng đối chứng thay dịch trích enzyme thô bằng
môi trường Nutrient broth không chủng vi khuẩn, sau đó tiến hành ủ mẫu ở 0

trong 24 giờ
Hoạt tính thuỷ phân protein được khảo sát qua diện tích vết loang trên môi
trường Skim Milk Agar (Cooper, 1963; Chantawannakula et al., 2002; Muhammad
Nadeem et al., 2007). Do protease của vi khuẩn Bacillus spp. tổng hợp được sẽ phân
huỷ casein trong sữa và tạo thành vết loang trong xung quanh giếng.
Đo đường kính vòng tròn thủy phân được sinh ra xung quanh giếng sau đó trừ đi
đường kính giếng để xác định hoạt tính protease do vi khuẩn Bacillus spp. sinh ra.
Các số liệu sau đó sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so
sánh sự khác biệt về hoạt tính protease của các dòng Bacillus spp. sinh ra.
Chọn lọc những dng có khả năng sinh enzyme có hoạt tính cao
- Hoạt tính enzyme của những dòng phân lập được tính bằng kích thước vòng
tròn thủy phân quanh miệng giếng trên đĩa.
- Hoạt tính enzyme được biểu hiện khi vòng tròn thủy phân rộng hơn 2mm.
- Dựa vào kích thước vòng tròn thủy phân:
+ Đường kính vòng tròn thủy phân < 5 mm: hoạt tính enzyme yếu.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

17
+ Đường kính vòng tròn thủy phân từ 5 đến 10 mm: hoạt tính enzyme trung
bình.
+ Đường kính vòng tròn thủy phân > 10 mm: hoạt tính enzyme mạnh.
- So sánh hoạt tính enzyme của các dòng và chọn lọc ra 1-3 dòng vi khuẩn
Bacillus spp. có hoạt tính enzyme cao.
3.2.5. Khảo sát nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn
Thí ngiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại. Mỗi bình tam giác chứa 100 mL môi
trường nuôi cấy Bacillus lỏng theo các nghiệm thức ở Bảng 1. Môi trường được khử
trùng nhiệt ướt (121
o

. Sau khi pha loãng dùng micropipette hút
5μL dung dịch nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường chứa glucose, mỗi độ pha loãng 3 lần