Nghiên cứu tạo và bước đẩu đánh giá
thời gian tuần hoàn trong máu của
liposom doxorubỉcin gắn
polyethylen glycol
Bùi Bá Minh', Nguyễn Thị Lập^
'Wớf Viện Quân Y, ^Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY
The present study demonstrated that a sterically stabilized liposomes, nanoscaled PEG conjugate ofDSPE modified doxorubicin
liposomes can be prepared by lipid film hydration method and pH gradient technique. The results from evaluation o f particle size,
morphology and physicochemical properties o f desired products showed the obtained products were almost acceptably homogenous
and stable.The average size o f the majority o f liposomes is around 135 nm and 124 nmfor liposomal doxorubicin without PEG and
liposomal doxorubicin conjugated PEG, respectively. The liposomal efficiency o f Dox loading was rather good, reached from 82 to
90%. Especially, the results showed some o f the benefits associated with the use o f PEG modified liposomes, such as increased blood
levels and enhanced circulation lifetime.
Từ khóa: liposom doxorubicin, polyethylen glycol, thời gian tuần hoàn trong máu.

Đặt Vấn đề
Một trong những nhược điểm lớn nhất khi sử dụng
các chê' phẩm liposom là nhanh chóng bị thải trừ khỏi
vòng tuần hoàn do sự tóm bắt của các tế bào thuộc hệ
thực bào đơn nhân (MPS). Gắn các polyme thân nước,

phospholipid và cholesterol, chưa có nghiên cứu nào
sử dụng các dẫn chất polyme để làm tăng thời gian
tuẩn hoàn của liposom Dox. Do đó, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu tạo liposom Dox gắn PEG và bước đầu
đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm tới thời gian tuần
hoàn trong máu.

đặc biệt là polyethylen glycol (PEG) là một biện pháp


Laysanbio (Mỹ), doxorubicin được cung cấp bởi

quả đáng khích lệ. Tuy nhiên, hẩu hết các nghiên cứu

Merck (Đức). Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân
tích.

chỉ dừng lại ở việc chế tạo liposom từ nguyên liệu là


A
Thiết bị
Màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 0,4 um và
0,08 |am (Sigma-Aldrich, Mỹ). Túi thẩm tích MWCO:
12000 - 14000 Da (Spectrum Labs - Mỹ). Máy

Hình thái của liposom tạo thành: Chụp mẫu
liposom bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Đưa mẫu sau khi xử lý lên lưới đóng có phủ màng
collodion-carbon. cố định mẫu, rửa mẫu và nhuộm

Emulsiílex - C5 (Canada). Máy đo quang phổ huỳnh
quang Shimadzu RF1501 (Nhật Bản). Máy cất quay
BUCHI R-210 (Thụy Sỹ). Kính hiển vi điện tử truyền

bằng dung dịch urani acetat 1%. Quan sát dưới kính

qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)


dịch NaCI 0,9% và 9 ml dung dịch Triton X -1001 %.
Nghiên cứu ảnh hưởng của sự gắn PEG lên bề
mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của
liposom doxorubicin

Phương pháp nghiên cứu
Tạo liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol
Tạo các tiểu phân liposom Dox gắn PEG theo

Tiến hành theo phương pháp của Gabizon, et.
al., [2] có cải tiến và đã được thẩm định. Chuột nhắt
trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực, có khối
lượng từ 22 - 27 g do Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương

phương pháp của Li, et. al., [8] được cải tiến, mô tả
tóm tắt như sau: phospholipid trứng đã hydro hóa,

cung cấp. Chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm

cholesterol và DSPE-PEG^^i^/NH^Ítỷlệ mol 1,85:1:0,15
tương ứng) được hòa tan vào 15 ml cloroform, cất

ứng với liểu 10 mg Dox/kg trong thể tích tiêm 10
ml/kg: nhóm 1 (tiêm Dox dạng tự do đã được pha
trong nước muối sinh iý), nhóm 2 (tiêm liposom Dox

quay chân không ở nhiệt độ 50“C. Hydrat hóa màng
mỏng thu được bằng dung dịch đệm citrat 300 mM,
pH 4 ở 50°c trong 2 giờ. Hỗn dịch liposom thu được
đẩy qua màng polycarbonat kích thước lỗ 0,40 |am


lấy phẩn dịch rồi định lượng Dox toàn phần trong

Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân

huyết tương được bằng phương pháp quang phổ

và thế zeta: Xác định bằng thiết bị Zetasizer ZS90

huỳnh quang ở bước sóng kích thích 471 nm, bước

(Anh) sau khi pha loãng hỗn dịch 200 lẩn bằng dung

sóng phát xạ 554 nm.Từ mật độ huỳnh quang thu

dịch NaCI 0,9% đã lọc qua màng lọc 0,2 um.

được, nồng độ tương đương Dox sẽ được xác định


dựa vào đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch
Dox đã biết trước nồng độ.

Bâng 2. ĩhéZeta và độ di chuyền cùa cóc mâu liposom
Mẫu liposom

Phương pháp xử lý số liệu

Thế Zeta (mV)



PE6-liposom Dox

-8,88

-0,6963

Kết quả nghiên cứu
Kết quả chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo
Đánh giá đặc tinh của các tiểu phân liposom
Dox tạo thành

ra có hình tròn, kích thước tương đỗi đổng nhất.

Kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích
thước tiểu phân của liposom Dox (không gắn PEG)
và PEG-liposom Dox (gắn PEG) tạo thành trước và
sau khi tải Dox được trình bày trong bảng 1.
Bảng l Kích thước tiếu phân và chì số đa phân tán (PDI) CÙQ các máu liỊxsom
Mẫu liposom

PDI

KTTB theo đường kính (nm)

Liposom

0,074

108,9


KV*«O.OkV
Dir«cl Mag: laooox

TUMMode: laagỉng

Kết quả bảng 1 cho thấy các liposom trước khi
tải Dox không có sự khác biệt đáng kể về kích thước
lẫn chỉ số PDI giữa liposom gắn và không gắn PEG.

soo nm

Hình l Hmh ánh chụp TEM của liposom doxorubiơn gân PEŨ ở độ phóng đợi 12.000 lân

Tiếp theo, bảng 3 thể hiện hiệu suất liposom hóa
Dox của 2 dạng chế phẩm gắn và không gắn PEG.

Đa số các liposom tạo thành có kích thước khoảng
100 nm. Sau quá trình tải Dox, kích thước trung bình

Kết quả cho thấy hiệu suất liposom hóa của PEG -

của 2 mẫu liposom tăng lên và đạt kích thước tiểu

liposom Dox thu được là tương đối cao (82,54%),

phân trung bình khoảng 130 nm. Chỉ số đa phân tán

không khác nhiều so với dạng liposom Dox không


PEG-liposom Dox

1,901

1,569

82,54

liposom không gắn PEG (trước và sau tải Dox) có giá
trị tuyệt đối > 30 mV cho thấy khả năng ổn định của

Hiêu suất
(%)

Mẫu liposom

hệ là khá cao. Thế Zeta của liposom gắn PEG thấp,
tương ứng với -10,1 mV (trước khi tải thuốc) và - 8,88
mV (sau khi tải Dox). So với liposom không gắn PEG,
liposom gắn PEG di chuyển chậm hơn.


Ảnh hưởng của gắn PEG /én bề mặt liposom tới
thời gian tuồn hoàn của liposom trong máu
Nồng độ tương đương Dox trong huyết tương
chuột nhắt tại các thời điểm 5 phút, 4 giờ và 24 giờ

đẩy cuối cùng với kích thước lỗ lọc là 80 nm để tạo
ra các liposom có kích thước khoảng 100 nm. PEGLiposom Dox tạo thành có kích thước trung bình
124,9 nm của sản phẩm thu được trong nghiên cứu


PEG-liposom Dox

sự di chuyển của liposom trong điện trường và làm
giảm thế Zeta [4], Ngoài ra, thế Zeta còn giảm do

0,083

13,79 ±1,33

5,09 + 1,98

24

133,73 ±
10,98

152,491
14,06

p,,
tiên (5 phút). Liposom gắn PEG cho nồng độ tương

(bảng 3) chỉ đạt hơn 80%. Điểu này có thể khi thẩm
tách loại thuốc tự do trong khoảng thời gian dài (24

đương Dox cao nhất ở cả 3 thời điểm khảo sát. Nồng
độ tương đương Dox trong huyết tương giữa 2 chê'

giờ) ở nhiệt độ phòng làm cho thuốc trong liposom

phẩm liposom khác biệt rõ rệt theo thời gian; tại thời
điểm 4 giờ, dạng liposom Dox gắn PEG cao hơn gấp
2 lẩn so với dạng liposom không gắn PEG và đến 24

sử dụng thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc phương pháp
sắc ký lọc gel để làm giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt
độ cao của liposom.
Về ảnh hưởng PEG bề mật liposom tới thời gian

Kết quả cho thấy nồng độ tương đương Dox của

giờ, sự khác biệt này lên tới gắn 6 lần.
Bàn luận

về đặc tính của các tiểu phân Hposom Dox tạo
thành
Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng,

bị rò rỉ, dẫn đến giảm hiệu suất. Để khắc phục có thể



bị thải trừ [3]. Do đó, nghiên cứu này lựa chọn màng

điểm khảo sát. Do đó, độc tính của Dox trên các mô


bình thường sẽ giảm đi khi sử dụng liposom làm hệ

các thời điểm xa (4 giờ, 24 giờ) phán nào chứng minh

mang thuốc.

khả năng của PEG kéo dài thời gian tuần hoàn trong
máu của liposom.

Mặc dù chưa tách riêng được liposom trong huyết
tương để định lượng nổng độ thuốc trong liposom
nhưng sự phân bố và chuyển hóa nhanh chóng của

Kết luận

Doxtựdocũng là cơ sở cho thấy phẩn lớn Dox trong
huyết tương tồn tại ở dạng trong liposom. Kết quả

Nghiên cứu đã tạo được liposom Dox gắn PEG

này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó [2,7],

tương đối đồng nhất, có kích thước trung bình


lating liposomes, Cancer Research, 52(4), pp. 891-896.
3.David

c Litzinger, et al. {1994), Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly (ethylene

glycolj-containing liposomes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1190(1), pp. 99-107.
4.Federico Perche, Vladimir p Torchilin (2013), Recent trends in multifunctional liposomal nanocarriers for enhanced tumor targeting.
Journal o f Drug Delivery.8{9)-A 509-1528.
5.KostasKostarelos, Andrew D Miller (2005), What role can chemistry play in cationic liposome-based gene therapy research today?,
Advances in genetics, 53, pp. 69-118.
5.MC Woodle, et al. (1992), Sterically stabilized liposomes. Reduction in electrophoretic mobility but not electrostatic surface potential,
Biophysicaljournal, 61 (4), pp. 902-910.
7.Ruey-Long Hong, et al. (1999), Direct comparison of liposomal doxorubicin with or without polyethylene glycol coating in C-26 tumorbearing mice is surface coating with polyethylene glycol beneficial?, Clinical cancer research, 5(11), pp. 3645-3652.
8.

XueMing Li, et al. (2009), Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin, Internationaljournal of

pharmaceutics, 373(1), pp. 116-123.