-1-

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA
-------  -------

Nghiên cứu chiết tách, xác định alcaloit
trong vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena
antidysenterica)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Ngành cử nhân hóa dƣợc

GVHD

: Th.S Đỗ Thị Thúy Vân

SVTH
Lớp

: Phạm Ngọc Văn
: 08CHD


-2-

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay ngành công nghiệp dược đã sản xuất ra khoảng 10.000 biệt dược
từ khoảng 3000 hoạt chất khác nhau nhưng lại đang tồn tại tối thiểu 30.000 loại

chịu thuốc rất ít hoặc không đáng kể.
Trên thế giới có các công trình nghiên cứu Holarrehena antidysenterica
như: Đánh giá hoạt động chống oxy hóa hạt giống của Holarrehena
antidysenterica trong các mô hình in vitro của sở Y sinh học phòng thí nghiệm
khoa học và quản lý đại học Vidyasagar Ấn Độ thực hiện. Nghiên cứu ảnh
hưởng của các alkaloid có trong loài Holarrhena antidysenterica tới việc điều trị
kháng khuẩn do cục Hóa sinh, Đại học Madras, Guindy Campus Ấn Độ thực
hiện. Nghiên cứu steroidal alkaloids từ vỏ của loài Holarrhena do Phòng nghiên
cứu thí nghiệm khu vực (CSIR), Jammu Tawi Ấn Độ thực hiện.
Trong nước có công trình nghiên cứu như: Đề tài nghiên cứu chiết tách và
thử hoạt tính chống ung thư từ cây Mộc hoa trắng của viện sinh thái và tài
nguyên sinh vật. Thuốc Mộc hoa trắng, viên nén bao phim do Công ty CP Dược
& TBYT Hà Tĩnh sản xuất.
Nhận thấy trong cây có chứa nhiều alcaloit và những ứng dụng của nó trong
thực tế như vậy nên việc nghiên cứu để xây dựng một quy trình chiết tách hỗn
hợp alcaloit từ vỏ cây Mức hoa trắng, từ đó xác định thành phần hóa học chính
của nó là một vấn đề cần thiết. Vì lý do trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
chiết tách, xác định alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena
antidysenterica) xã Đại Tân, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam”.
2. Đối tƣợng nghiên cứu
Vỏ cây Mức hoa trắng ở xã Đại Tân, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam.
3. Mục đích nghiên cứu


-4-

- Xây dựng quy trình chiết tách alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng.
- Xác định thành phần hoá học, cấu trúc các alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Nguyên cứu lí thuyết

vài (Thổ), Mức lông, Hồ liên lá to.
- Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
- Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
- Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae)
- Bộ Trúc đào (Apocynales)
- Họ Trúc đào (Apocynaceae)
- Chi Holarrhena
1.1.2. Đặc tính thực vật và phân bố [11]
Cây gỗ to mọc thẳng đứng có thể cao trên 10 m, có nhựa mủ trắng. Thân
già màu nâu đen xù xì, có lớp vỏ dày, thân non màu xanh hoặc màu đỏ nâu có
nhiều lông che chở màu trắng (hình 1.1).

Hình 1.1: Quả, lá và thân cây


-6-

Lá đơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình xoan hoặc hình trứng đỉnh kéo dài
thành mũi nhọn dài 0,5-1 cm, màu xanh đậm mặt trên hơn mặt dưới, có lông
trắng ở mặt dưới nhiều hơn mặt trên, kích thước dài 7-11 cm, rộng 5-6 cm.
Gân lá hình lông chim, 9-13 cặp gân phụ cấp 1 hơi chếch không đối nhau
chạy sát mép và nối nhau ở mép rất mờ, gân phụ cấp 2 hình lưới rõ.
Cuống lá ngắn, hình trụ, dài 0,5-0,6 cm, màu xanh, nhiều lông. Không có
lá kèm.
Cụm hoa xim 2 ngả mọc ở nách lá hoặc ở ngọn cành, cuống cụm hoa dài
1,5-2 cm.
Hoa màu trắng, thơm, đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 1-1,5 cm,
màu xanh, có lông dày.
Lá bắc và lá bắc con dạng vẩy màu xanh có lông, tồn tại lâu. Đài hoa: 5 lá
đài nhỏ, đều, rời, màu xanh, dạng vẩy dài 0,15-0,2 cm, rộng 0,7-1 cm, mặt ngoài

Phú Thọ, Hà Tây, Hòa Bình và nhiều tỉnh khác. Mùa hoa: tháng 3-7, mùa quả:
tháng 6-12.
* Bộ phận dùng:
Lá, hạt, vỏ thân và rễ
Vỏ cây thu hái vào tháng 2 - 3. Phơi hoặc sấy khô.
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học [3]
Vỏ thân chứa 9,5% gôm; 6,2% chất nhựa; 1,14% tannin; triterpen alcol;
lupeol; β-sitosterol; ankan và nhiều alcaloit.
Hàm lượng alcaloit thay đổi tùy theo sự phát triển của cây, cao nhất vào
lúc cây 8 – 12 tuổi.
Hàm lượng alcaloit toàn phần: 0,22 – 4,2% trong vỏ. Cho tới nay đã tìm
thấy nhiều alcaloit như: conessimin (C 23H28N2), isoconessimin (C23H38N2),


-8-

holarimin (C21H34N2O), conimin (C22H36N2), conarimin (C21H34N2), holaremin
(C24H38ON2), cokurchin (C21H32N2), conessidin (C22H34N2)… Đặc biệt conessin
là alcaloit chính trong cây.
R

R1

R2

R3

Conarimin

H


Me

H

H

Isoconessimin Me

H

Me

H

Conessin

Me

Me

Me

H

Holarenin

Me

Me

R3

CH3

12
11

2

R
N

H

CH3

1

9

10

H

5

14
8

H


10
5

H

13
14
8

H

7

3
4

H

6

1.3. Tính chất chung của alcaloit [3]
1.3.1. Lý tính
- Những alcaloit có oxi thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường
- Những alcaloit không có oxi thường ở thể lỏng nhưng cũng có những chất
không có oxi ở thể rắn như Conessin...
- Các alcaloit ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng. Các
alcaloit ở thể lỏng bay hơi được và thường không bền vững.




Nó là một loại thuốc nổi tiếng với bệnh lỵ amoebic và rối loạn dạ dày
khác. Nó cũng được chỉ định trong tiêu chảy, khó tiêu, đầy hơi và đau bụng.
* Công dụng
Thân và các bộ phận khác được dùng làm thuốc trị lỵ amip, dùng dưới
dạng bột, cồn thuốc hoặc cao lỏng chữa lỵ amip. Liều dùng 1 ngày: vỏ cây khô
3-10g, hoặc hạt 3-6g. Còn dùng dưới dạng alcaloid toàn phần, hoặc conessin.
Dùng vỏ cây hoặc lá nấu nước tắm chữa ghẻ. Vỏ rễ giã ngâm rượu cùng với rễ
hòe bôi ghẻ.
1.5. Các phƣơng pháp kỹ thuật
1.5.1. Xác định độ ẩm trong vỏ cây Mức hoa trắng
* Cơ sở của phƣơng pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học
gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w.
Trong đó:
m: khối lượng chung của nguyên liệu.
mo: khối lượng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm).
w: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (nước tự do).
Độ ẩm tương đối (ω) của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước
trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:



w
w
.100 
.100
m
mo  w

1.5.2. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng

thấy trong vùng nồng độ C nhỏ, mối quan hệ giữa cường độ vạch phổ hấp thụ và
số nguyên tử của nguyên tố tuân theo định luật Lămbe-Bia: D= lC.
1.5.3.2. Nguyên tắc của phép đo AAS
Trên cơ sở của sự xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử, chúng ta thấy phổ hấp
thụ nguyên tử chỉ sinh ra được khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và
trong mức năng lượng cơ bản. Do vậy, muốn thực hiện được phép đo AAS cần
phải thực hiện các công việc sau:
1. Hóa hơi mẫu phân tích, đưa vật mẫu về trạng thái khí.
2. Nguyên tử hóa đám hơi đó, tức là phân ly các phân tử để tạo ra các đám
hơi các nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích ở trong mẫu có khả


-12-

năng hấp thụ bức xạ đơn sắc. Hai công việc này được gọi là quá trình nguyên tử
hóa mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và ảnh hưởng đến quyết định kết quả
của phép đo AAS vì nó tạo ra môi trường hấp thụ nguyên tử của phép đo.
3. Chọn nguồn phát tia sáng có bước sóng phù hợp với nguyên tố phân
tích (bức xạ cộng hưởng) và chiếu vào đám hơi đó, như vậy phổ hấp thụ sẽ xuất
hiện.
4. Thu toàn bộ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly
chúng thành phổ và chọn 1 vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích để hướng
vào khe đo, để đo cường độ của nó.
5. Thu và ghi lại kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị
ghi và xử lý thích hợp.
1.5.4. Phƣơng pháp chiết
* Giới thiệu chung
Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách
và tinh chế để tách chất đó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác.
Trong đề tài này tôi sử dụng hai phương pháp chiết chính là:

pháp cộng hưởng spin-electron-miền sóng viba-và cộng hưởng từ hạt nhân).
Phương pháp này cho phép nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc phân tử
và sự hấp thụ bức xạ do đó dẫn tới làm sáng tỏ mối quan hệ giữa cấu tạo và màu
sắc của các chất.
1.5.6. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ GC-MS
1.5.6.1. Phƣơng pháp sắc ký khí (GC)
* Nguyên tắc hoạt động: Nhờ có khí mang trong bom chứa trong bom khí
(hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong


-14-

buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại
các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại đó chúng được
chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ
ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang
bộ phận in và lưu kết quả (bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi). Trên sắc đồ nhận
được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic.Thời gian lưu của pic
là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích. Diện tích pic là thước đo định
lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Sắc đồ là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào
thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định
được thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
1.5.6.2. Phƣơng pháp khối phổ (MS)
* Nguyên tắc của phương pháp khối phổ: Dựa vào chất nghiên cứu được
ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không bằng những phương
pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử,ion mảnh) có số khối khác nhau,
sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m
(chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của
mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có

2.1. Nguyên liệu
- Vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens) được lấy vào tháng 9 năm 2011
ở huyện Đại Lộc tỉnh Quảng Nam.
- Vỏ cây tươi cạo lớp vỏ bên ngoài, sau đó phơi khô ngoài nắng và nghiền thành
bột mịn rồi cho vào lọ thủy tinh sạch để bảo quản nơi khô ráo thoáng mát.
2.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất
- Acid hydroclorid 5%, sữa vôi, cát mịn, cồn, hecxan, dung dịch NaOH.
- Dung môi dùng cho sắc ký khí ghép khối phổ (Merck) đạt tiêu chuẩn.
2.2.2. Thiết bị thí nghiệm
- Phễu lọc Buchner, cân phân tích, tủ sấy, tủ nung, máy cô quay chân không, bộ
chiết soxhlet, bếp điện, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, cốc sứ, bình
hút ẩm,…
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GS-MS.
- Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân tích trọng lƣợng
Áp dụng phương pháp phân tích trọng lượng để phân tích các yếu tố sau:
- Khảo sát độ ẩm
- Khảo sát hàm lượng tro
2.3.2. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS


-17-

- Xác định hàm lượng kim loại nặng trong vỏ cây Mức hoa trắng.
2.3.3. Phƣơng pháp chiết chất rắn
- Chiết nóng bột vỏ cây Mức hoa trắng khô trong dung môi HCl 5%.
2.3.4. Phƣơng pháp vật lý

3.1. Nguyên liệu
Vỏ cây sau khi đã phơi khô ta đem nghiền mịn thành bột rồi cho vào bình
thủy tinh sạch bảo quản (hình 3.1).

Hình 3.1: Vỏ cây khi phơi khô và sau khi xay
mịn
3.2. Xác định một
số chỉ số vật lý
3.2.1. Xác định độ ẩm trong bột vỏ cây Mức hoa trắng
 Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ẩm ở 1000C đến khối lượng không đổi. Từ đó
suy ra khối lượng nước tự do trong nguyên liệu.
* Cách tiến hành:
Chuẩn bị sẵn 5 chén sứ sạch, đã được sấy khô trong tủ sấy đến 1000C và
đánh số từ 1 đến 5. Đặt vào bình hút ẩm, làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Cho vào mỗi chén sứ 5 g bột vỏ cây Mức hoa trắng. cân chén và mẫu: m1.
Sau đó, tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C, sau 1 giờ lấy ra cân, cứ như
vậy đến khi thu được kết quả tổng khối lượng của mẫu và chén không đổi m2 thì
cho vào bình hút ẩm để làm nguội. Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số của tổng khối
lượng chén và mẫu trước khi sấy so với tổng khối lượng chén và mẫu sau khi sấy


-19-

Hàm lượng % ẩm được tính theo công thức:
W(%) 

m1  m2
100%
m



34.960

12,700

2

30,226

35,150

5,092

34,507

12,790

3

31,182

36,280

5,098

35,618

12,980

4

W (%): độ ẩm của mỗi mẫu.

Từ bảng 3.1 thu được độ ẩm bột vỏ cây Mức hoa trắng là 12,868%.
3.2.2. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng
* Nguyên tắc: Tro hoá hoàn toàn mẫu ở nhiệt độ 5000C – 6000C khoảng 8 giờ.


-20-

* Cơ sở của phƣơng pháp : Mẫu nguyên liệu khô có thành phần gồm vô cơ
(tro) và hữu cơ.
Hàm lượng tro là khối lượng giữa mẫu sau khi tro hóa so với khối lượng
nguyên liệu ban đầu. Vì sau khi tro hóa ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ trong
mẫu nguyên liệu đã bị phân hủy và bay hơi hết, còn lại tro là phần vô cơ.

H (%) 

m3  m0
 100%
m

Trong đó: m0: Khối lượng chén sứ
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
 Cách tiến hành:
Từ 5 mẫu vỏ cây Mức hoa trắng vừa được xác định độ ẩm ở thí nghiệm
trên, đem than hóa trên bếp điện trong vòng 2 giờ. Sau đó đem tro hoá ở 500 0C –
6000C trong lò nung với thời gian 8 giờ cho đến khi tro có màu trắng. Lấy mẫu
ra, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm và cân lại mẫu để xác định hàm lượng tro.
Kết quả xác định hàm lượng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng được thể hiện

6,952

3

31,182

5,098

31,567

7,551

4

36,231

5,311

36,606

7.060

5

30.500

5,166

30,859



Zn2+

37,7930

Pb2+

0,3711

* Nhận xét: Theo quyết định số 867/1998 QĐ-BYT ngày 04/4/1998 của
Bộ Y tế về việc ban hành “Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực
phẩm” thì giới hạn tối đa cho phép của Zn là 40 (mg/l) và Pb là 2 (mg/l). Trong
mẫu đo được Zn là 37,7930 (mg/l) và Pb là 0,3711 (mg/l). Như vậy hàm lượng
kim loại nặng trong mẫu nằm trong giới hạn cho phép.
3.3. Kết quả chiết tách các hợp chất trong vỏ cây Mức hoa trắng
3.3.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết
3.3.1.1. Phƣơng pháp chiết ở nhiệt độ phòng
Lấy 10g bột vỏ cây Mức hoa trắng đã nghiền mịn vào bình tam giác. Tiếp
tục cho vào bình 150ml dung dịch HCl 5%, sau đó đậy kín nắp để trong bóng tối
3 ngày.
Sau đó đem lọc, kết quả thu được dịch lọc như hình 3.3.

Hình 3.3: Dịch lọc ngâm ở nhiệt độ phòng


-23-

Dịch lọc thu được cho kiềm hóa bằng dung dịch vôi sữa. Khi tiến hành
kiềm hóa thấy không có hiện tượng gì.
3.3.1.2. Phƣơng pháp chiết nóng

MAU2
MAU1
MAU3

MAU4

Hình 3.7: Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết với các tỉ lệ R/L
khác nhau


-25-

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ R-L đến độ hấp thụ.
Mẫu

Nguyên liệu (g)

Vdm(ml)

Độ hấp thụ tại λmax = 275,9 nm

1

15

100

1.048

2

0.2
0
0

50

100

150

200

250

300
Vml

Hình 3.8: Biểu đồ giữa độ hấp thụ phân tử với các thể tích khác nhau
* Nhận xét: Ở cùng một khối lượng như nhau, nhưng chiết với tỷ lệ dung
môi khác nhau. Thì độ hấp thụ tăng theo độ tăng thể tích từ 100 ml đến 150 ml,
sau đó độ hấp thụ giảm mạnh theo thể tích từ 150 ml đến 200 ml, rồi độ hấp thụ
giảm ít theo thể tích từ 200 ml đến 250 ml. Vậy ở thể tích dung môi là 150 ml có
độ hấp thụ lớn nhất. Do đó tỷ lệ chiết tối ưu là 1/10 (g/ml).
3.3.2.2. Khảo sát thời gian chiết
- Lấy 10g bột dược liệu cho vào 4 bình tam giác, sau đó cho 150ml dung
dịch HCl 5% vào mỗi bình đó. Đun 4 bình trên trong bếp cách thủy ở nhiệt độ
800C trong thời gian lần lượt 4h, 6h, 8h, 10h rồi lọc qua giấy lọc thu được dịch
lọc.
- Các dịch lọc đem pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.