BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LAN NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHTALAT
TRONG BAO BÌ DƢỢC PHẨM LÀM TỪ
CHẤT DẺO BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LAN NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHTALAT
TRONG BAO BÌ DƢỢC PHẨM LÀM TỪ
CHẤT DẺO BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT


MỤC LỤC
Trang

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

1.1. Tổng quan về phtalat ........................................................................................... 3
1.1.1. Công thức cấu tạo và tên gọi một số phtalat .............................................. 3
1.1.2. Tính chất ..................................................................................................... 4
1.1.3. Ứng dụng của các phtalat ........................................................................... 4
1.1.4. Độc tính của phtalat.................................................................................... 5
1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng phtalat ............................................................... 5
1.3. Tổng quan về sắc ký khí khối phổ .................................................................... 12
1.3.1. Sắc ký khí ................................................................................................. 12
1.3.2. Dectector khối phổ trong sắc ký khí ........................................................ 15
1.3.3. Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ ........................................................... 18
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................... 20
2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, dung môi............................................................... 20
2.2.1. Thiết bị ..................................................................................................... 20
2.2.2. Dụng cụ .................................................................................................... 20

4.2. Về quy trình phân tích ....................................................................................... 62
4.3. Kết quả thẩm định phƣơng pháp ..................................................................... 63
4.4. Ứng dụng của phƣơng pháp phân tích............................................................. 64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AOAC
CI
DBP
DEHP
DEP
DCM
EI
FID
GC
GCL
HPLC
IS
LC
LOD
LOQ
MS
ppm
SIM
THF


Bảng 3.1: Kết quả thời gian lưu (phút) của các phtalat khi phân tích theo các
chương trình nhiệt độ khảo sát. .................................................................................30
Bảng 3.2: SIM group với các mảnh ion cho từng chất .............................................33
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết DEP và DBP ........................................38
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát dung môi chiết DEHP ...................................................39
Bảng 3.5: Kết quả thẩm định tính phù hợp của hệ thống ..........................................43
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của DEP, DBP, DEHP……........... 48
Bảng 3.7: Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn ......................................................52
Bảng 3.8: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn
DEP tại các nồng độ khác nhau.................................................................................54
Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn
DBP tại các nồng độ khác nhau ................................................................................55
Bảng 3.10: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn
DEHP tại các nồng độ khác nhau ..............................................................................56
Bảng 3.11: Kết quả phân tích các mẫu thực..............................................................58


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của phtalat [17].................................................3
Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí ....................................................................12
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ ......................................................................16
Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 1…………….29
Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 2…………….29
Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 3…………….30
Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 4…………….30
Hình 3.5: Phổ khối DEP so với thư viện phổ chuẩn. ................................................32
Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi DCM .............................35
Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi toluen ............................35
Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi n-hexan .........................36
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi THF ..............................36

phtalat điển hình sử dụng nhiều nhất xuất hiện trong chất dẻo là Di(2ethylhexyl) phthalat (DEHP), Dibutyl phthalat (DBP), Diethyl phthalat (DEP)
và một số phtalat khác [21].
Tuy nhiên, do phtalat không tạo liên kết hóa học bền vững với chất dẻo,
nên trong các điều kiện ánh sáng và nhiệt độ thường, theo thời gian phtalat có
thể bị giải phóng thoát ra khỏi nền polymer chất dẻo, đặc biệt là các phtalat
phân tử lượng thấp như DEP và DBP, và có thể gây hại cho môi trường cũng
như sức khỏe con người [13]. Thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu và báo cáo
về tính chất nguy hiểm của phtalat gây độc với hệ thần kinh, gan, thận, rối
loạn hormon, trẻ em dậy thì sớm, vô sinh, ung thư [8], [10], [11], [23]. Do
những nguy cơ đó, Mỹ đã ban hành luật quy định cấm các sản phẩm đồ chơi
trẻ em và đồ chăm sóc trẻ em làm từ chất dẻo có hàm lượng một số phtalat
(DEHP, DBP, BBP, DINP, DIDP, DnOP) không được vượt quá 0,1% [16].
Tại Việt Nam, phtalat là vấn đề mới mẻ hiện đang thu hút sự quan tâm của
công chúng, đặc biệt là các nhà nghiên cứu tìm cách định tính, định lượng
phtalat trong nhiều đối tượng khác nhau như đồ chơi, thực phẩm, bao bì thực
phẩm, …. Trong ngành Dược, bao bì chủ yếu được làm từ chất dẻo, nên nếu

1


phtalat trong bao bì có hàm lượng cao sẽ có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe
người sử dụng thuốc. Trên thế giới, năm 2009 Dược điển Châu Âu đưa vào
phương pháp định tính, định lượng DEHP trong bao bì chất dẻo với yêu cầu
hàm lượng DEHP trong bao bì chất dẻo (bao bì dùng đựng máu và các chế
phẩm từ máu; đựng thuốc tiêm truyền) không quá 40% [20]. Tuy nhiên, trong
bao bì chất dẻo không phải chỉ có riêng DEHP mà còn có thể có nhiều loại
phtalat khác nhau như DBP, DEP, … Việt Nam tuy chưa có những quy định
pháp lý yêu cầu định tính, định lượng nhiều loại phtalat khác nhau trong bao
bì dược phẩm làm từ chất dẻo, nhưng trước những mối nguy hại của các
phtalat trong đồ nhựa, đồ chơi, bao bì,… đã được thế giới cảnh báo, giới hạn

Tên gọi

Kí

Công thức phân tử

hiệu

T

M
(g/mol)

T
1

Dimethyl phtalat

DMP

C6H4(COOCH3)2

194,19

2

Diethyl phtalat

DEP



Di(2-ethylhexyl)

DEHP

phtalat
6

Diisononyl

C6H4[COOCH2CH(C2H5)(CH2)3CH3] 390,56
2

DINP

C6H4[COO(CH2)6CH(CH3)2]2

418,62

DUP

C6H4[COO(CH2)10CH3]2

474,72

C6H4[COO(CH2)12CH3]2

530,83

phtalat

- Ngành công nghiệp thực phẩm sử dụng phtalat làm chất tạo độ đục hoặc tạo
vẻ hấp dẫn cho thực phẩm [5], [6], [26].
1.1.4. Độc tính của phtalat
Đã có rất nhiều nghiên cứu trên động vật thử nghiệm và báo cáo về độc
tính của phtalat trên các hệ cơ quan khác nhau. Các phtalat (như DEP, DBP,
DEHP,…) làm chậm tốc độ phát triển của trẻ em, gây độc với gan, thận, ảnh
hưởng tới hệ thần kinh, rối loạn hormon, làm trẻ em dậy thì sớm, vô sinh, ung
thư [8], [10], [11], [23].
Chen F.P và Chien M.H (2014) đã nghiên cứu trên động vật thử
nghiệm, thấy tại nồng độ rất thấp 10-10 – 10-4 mol/l, các phtalat đã có khả năng
làm tăng nhanh sự phát triển các tế bào ung thư vú [14].
1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng phtalat
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, trên thế giới đã có một số nghiên cứu
định lượng phtalat trong các mẫu đối tượng khác nhau, sử dụng các phương
pháp khác nhau. Có thể tóm tắt một số nghiên cứu trong các bảng 1.2 và bảng
1.3:
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng phtalat bằng phương pháp GC
Tài

Mẫu thử

Điều kiện sắc ký

Chuẩn nội -

liệu

- Chất

Dung môi hoặc

5


PVC.

1ml/phút.

(THF) : ethanol

- Chất

- Chương trình nhiệt độ:

(1:3, tt/tt).

phân tích: Từ 100°C, tăng với tốc độ gia nhiệt
19

30°C/phút đến 200°C. Từ 200°C tăng

phtalat,

3°C/phút lên 250°C, duy trì trong 2,5

trong đó

phút. Sau đó tăng 40°C/phút lên tới

có DEP,


- Pha tĩnh: Cột mao quản HP-5MS

Dung môi chiết:

thử: Túi

(30m x 0,25mm, 0,25µm) với pha

n-hexan.

bao bì

tĩnh 5% polydiphenyl/95%

đựng

dimethylpolysiloxan.

thực

- Pha động: Khí mang heli, tốc độ khí

phẩm làm 1ml/phút.
từ nhựa

- Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban

Polyethyl đầu 150°C, giữ trong 0,5 phút, sau đó
en.


ion 230°C. Chế độ full scan với m/z =
35 – 550; Chế độ chọn lọc ion (SIM)
với mảnh ion m/z = 149.

[7]

- Mẫu

- Pha tĩnh: Cột mao quản KB-1 (30 m Dung môi chiết:

thử: sữa

× 0,25 mm, 0,25µm) với pha tĩnh

methanol :

hộp.

100% dimethylpolysiloxan.

carbontetraclorid

- Chất

- Pha động: Khí mang nitơ, tốc độ khí (20:1, tt/tt).

phân tích: 1,7ml/phút.
6 phtalat,

- Chương trình nhiệt độ:

- Với mật ong,

ong,

với pha tĩnh 5 % Diphenyl - 95%

dùng nước:hexan

7


thạch.

dimethylpolysilphenylen siloxan.

- Chất

- Pha động: Khí mang heli, tốc độ khí - Với thạch, dùng

phân tích: 37cm/s.

(1:1, tt/tt).

hexan:aceton

22

- Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu

phtalat,

với mảnh ion m/z = 149.
[18] - Mẫu

- Pha tĩnh: Cột mao quản DB-5MS (30 -Chuẩn nội:

thử: dầu

m × 0,25 mm × 0,25 µm) với pha

DEHP-d4

ăn thực

tĩnh silica nung chảy.

- Dung môi,

vật.

- Pha động: Khí mang heli tinh khiết,

phương pháp

- Chất

tốc độ khí mang 1ml/phút.

chiết: acetonitrile,

phân tích: - Chương trình nhiệt độ:

- Phát hiện: Detector MS; điều kiện
khối phổ: Nguồn ion hóa EI, năng
lượng bắn phá 70eV, nhiệt độ buồng
ion 230°C. Chế độ chọn lọc ion (SIM)
với mảnh ion m/z = 149.

[19] - Mẫu

- Pha tĩnh: Cột mao quản DB-5MS (30 - Chuẩn nội:

thử: xúc

m × 0,25 mm × 0,25 µm) với silica dibutyl adipate.

xích.

nung chảy

- Dung môi chiết,

- Chất

- Pha động: Khí mang heli, tốc độ khí

phương pháp
chiết: n-hexan,

phân tích: 1,2ml/phút.
6 phtalat,


Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lượng phtalat bằng sắc ký lỏng

Tài

Mẫu thử -

Điều kiện sắc ký

Chuẩn nội -

liệu

Chất phân

Dung

tích

môi/phƣơng
pháp chiết

[22] - Mẫu thử:

- Pha tĩnh: Cột C8 (100 mm ×

- Chuẩn nội:

Dụng cụ y tế 4,6 mm x 2,6µm).

benzyl butyl


nước tiểu

mm × 2.1 mm,3µm).

đồng vị 13C12

người.

- Pha động: hỗn hợp acid acetic :

- Dung môi chiết:

- Chất phân

acetonitril; tốc độ dòng: 220

amoni acetat pH

tích:

µl/phút; thể tích tiêm mẫu: 10 µl

5.0 : enzym β –

Bisphenol A

- Phương pháp, detector phát hiện:

glucuronidase


sinh lý.

nước; tốc độ dòng: 0,4 ml/phút; thể

- Chất phân

tích tiêm mẫu: 2 µl.

tích: 6

- Phương pháp, detector phát hiện:

phtalat, trong LC-MS; điều kiện khối phổ: Nguồn
đó có DEP.

ion hóa EI, năng lượng bắn phá
70eV.

Phương pháp HPLC-UV ít được sử dụng trong định lượng phtalat, do
phổ hấp thụ của phtalat không đặc trưng, giống với nhiều chất khác cũng có
một vòng benzen, bước sóng hấp thụ cũng không đặc trưng nên khả năng xác
định kém.
Các phtalat là ester của acid phtalic với 1 hoặc 2 rượu khác nhau, nên
tính chất và cấu tạo của chúng có tính tương đồng. Mặt khác, hàm lượng của
chúng trong mẫu lại thấp. Từ đó dẫn đến yêu cầu phương pháp phân tích
phtalat phải có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp,
phương pháp không bị ảnh hưởng khi phân tích đồng thời các phtalat. Phương
pháp GC và LC đều đáp ứng được yêu cầu đó. Để tăng thêm hiệu quả, sắc ký
khí thường được kết nối với MS, còn các detector khác như FID kém nhạy

detector. Nhiệt độ cột dao động khoảng 50°C - 350°C đảm bảo chất tan bay
hơi và đẩy nhanh quá trình rửa giải [1].
1.3.1.3. Hệ thống máy sắc kí khí

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí
12


* Khí mang:
Các loại khí mang sử dụng trong GC-MS cần phải đảm bảo trơ và sạch.
Khí mang không được tương tác với các chất phân tích, do đó yêu cầu đầu
tiên là phải trơ về mặt hóa học. Thường thì heli, hydro, argon hoặc nitơ có thể
đáp ứng yêu cầu. Hiện nay, khí mang sử dụng phổ biến nhất là heli [1].
* Buồng tiêm mẫu:
Trước khi vào cột phân tích, thường mẫu ở dạng lỏng, cho vào buồng
bay hơi rồi được dòng khí mang đưa vào cột. Có 3 cách tiêm mẫu chính: [4]
- Tiêm mẫu chia dòng (split): Mẫu sau khi vào buồng bay hơi, được chia
nhanh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lượng mẫu ban đầu đi vào cột. Các tỷ
lệ chia dòng phổ biến trong khoảng từ 1:50 đến 1:100. Cách tiêm mẫu này có
ưu điểm là giúp giảm lượng mẫu vào cột trong trường hợp mẫu bẩn hoặc có
nồng độ cao. Tuy nhiên, do lượng mẫu vào cột nhỏ nên có thể làm giảm độ
nhạy.
- Tiêm mẫu không chia dòng (splitless): Sau khi vào buồng bay hơi, mẫu
được đưa toàn bộ vào đầu cột và ngưng tụ lại ở đây, sau đó tăng nhiệt độ để
làm bay hơi dần các cấu tử. Phương pháp này có thể làm tăng độ nhạy và
phản ánh tương đối chính xác thành phần mẫu ban đầu, tuy nhiên có thể gây
ra pic bị rộng chân và làm hỏng cột phân tích.
- Tiêm mẫu trực tiếp (on-column): Trong một số trường hợp đặc biệt, khi
thành phần mẫu chứa các chất không bền với nhiệt, có nhiệt độ hóa hơi thấp
nên không thể bơm vào buồng bay hơi. Khi đó có thể tiêm thẳng vào đầu cột

Dài 10 – 100m (cuộn
Kích thước cột

tròn), đường kính trong
0,1 – 0,7mm, có áo bảo vệ
bằng polyimid hoặc nhôm

Dài 1 – 3m (cuộn tròn),
đường kính trong 2 –
3mm

Lớp chất lỏng dày 0,1 Pha tĩnh

5µm bao mặt trong của

Kích thước hạt 150 -

cột (WCOT) hoặc chất

250µm, được bao lớp

mang bao pha tĩnh

mỏng (dày 0,05 - 1µm)

(SCOT)
Chia dòng, không chia

Bay hơi nhanh, tiêm thẳng


trong ≤ 0,2 mm.
Chất tan được rửa giải ở

Thấp, tốt nhất chỉ có thể
tách được 20 thành phần

nhiệt độ thấp hơn so với
cột nhồi.
Ghi chú:
WCOT: Cột với lớp bao ở mặt trong thành cột (Wall – coated open tubular column)
SCOT: Cột với lớp chất mang pha tĩnh (Support – coated open tubular column)

* Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí [4]
Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất
khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa chọn loại
pha tĩnh phù hợp. Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm dựa vào tính
phân cực của nó, bao gồm: Nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm
phân cực trung bình, nhóm phân cực cao.
Một số loại pha tĩnh ngày nay hay sử dụng: Polydimethylsiloxan, 5%
phenyl polydimethyl siloxan; 50% phenyl polydimethyl siloxan; Polyethylen
glycol.
1.3.2. Dectector khối phổ trong sắc ký khí
1.3.2.1. Khái niệm
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân
tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion
mảnh của phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z) [1].

15



* Bộ phân tích khối (Mass analyzer):
Có vai trò tách các ion theo tỷ số m/z. Một số thiết bị phân tích khối
thường được dùng trong GC:
- Thiết bị phân tích tứ cực: Cấu tạo bởi 4 thanh điện cực đặt song song tạo
thành một khoảng trống, trong đó một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết
hợp giữa dòng một chiều và điện thế tần số radio (RF). Trường tứ cực được
xác định sao cho các ion có thể đi tới detector. Các tứ cực đóng vai trò như bộ
lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong đó
sẽ dao động phụ thuộc vào tỷ số m/z và RF. Chỉ những ion có tỷ số m/z phù
hợp mới có thể đi qua bộ lọc này.
- Bẫy ion: Gồm các điện cực hình trụ, điện cực hình mũ và điện cực vòng.
Mỗi điện cực này có các bề mặt hình hypebol ở bên trong. Các điện cực hình
mũ tạo ra một điện thế, còn điện cực vòng áp thế 1 MHz và điện thế 1 chiều.
Các ion được tạo ra bằng cách đưa vào các electron phát ra từ một dây dẫn
hoặc các ion có thể được đưa vào bẫy từ một nguồn bên ngoài. Trên cơ sở
tăng biên độ của thế RF, chuyển động của các ion tăng dần lên đến khi đường
đi của chúng không ổn định dọc theo hình trục của bẫy. Kết quả, các ion này
bị phóng ra khỏi các khe hở của điện cực hình mũ bên trái và được thu thập
lại ở bộ khuếch đại electron. Quá trình phóng các ion này theo trình tự tăng
giá trị m/z và tín hiệu thu được phản ánh phổ khối của các ion bị bẫy.
17