Môc lôc


Tóm tắt kết quả khóa luận
1. Tên đề tài
Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối và tái sinh cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.).
2. Đối tợng
Thí nghiệm đợc tiến hành trên củ cây Trinh nữ hoàng cung.
3. Mục tiêu
Nhằm tạo đợc nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính
quý của nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với sử
dụng phơng pháp nhân giống truyền thống.
4. Kết quả chính
1) Chế độ khử trùng phù hợp đối với mẫu củ cây Trinh nữ hoàng cung là chế
độ 2 (cồn 70% trong 30 giây, javen 50% trong 7 phút) cho tỷ lệ sống cao
nhất.
2) Môi trờng có tỷ lệ tạo mô sẹo cao là môi trờng TN3 (MS + 30 g/l đờng + 8
g/l agar + 2 mg/l NAA) và môi trờng TD3 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar +
2 mg/l 2,4-D). Ngoài ra môi trờng TN4 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar +
2,5 mg/l NAA) và TD4 (MS + 30 g/l đờng + 8 g/l agar + 2,5 mg/l 2,4-D)
cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao.
3) Môi trờng NB6 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA + 1 mg/l
BAP) và môi trờng NK6 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA +
1 mg/l kinetin) là thích hợp cho nhân sinh khối mô sẹo.
4) Môi trờng thích hợp cho tái sinh cây TNHC từ mô sẹo và lõi củ là MB 4
(MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + 2
mg/l BAP) và MK4 (MS + 8 g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa +
0,5 mg/l NAA + 2 mg/l kinetin).
5) Môi trờng CB3 (MS + 0,5 mg/l IBA + 0,2 mg/l GA 3 + 5 mg/l BAP + 8 g/l
agar + 30 g/l đờng) thích hợp cho việc nhân chồi TNHC.

nhân giống cây TNHC. Một trong các phơng pháp đó là nhân giống vô tính bằng
kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Đây là phơng pháp thể hiện tính u việt trong việc nhân
nhanh một dòng chọn lọc, có phẩm chất tốt, hàm lợng thành phần hoá học có tác
dụng dợc lý cao, tạo nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính


quý của nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng
pháp nhân giống truyền thống. Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, chúng tôi đã
tiến hành đề tài : Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh
khối và tái sinh cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) với những
nội dung sau:
1. Nghiên cứu chế độ khử trùng phù hợp với mẫu củ cây TNHC.
2. Nghiên cứu ảnh hởng nồng độ NAA, 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ củ
cây TNHC.
3. Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng nhân
sinh khối mô sẹo.
4. Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp giữa NAA, BAP, nớc dừa và kinetin đến
khả năng tái sinh cây.
5. Nghiên cứu ảnh hởng của sự kết hợp IBA, GA3 và BAP đến khả năng nhân
chồi.
6. Nghiên cứu ảnh hởng của IBA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh.


Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Sơ lợc về cây Trinh nữ hoàng cung
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
Trinh nữ hoàng cung (TNHC) có nguồn gốc từ ấn Độ. Tên khoa học của
TNHC là Crinum latifolium L. Loài latifolium thuộc chi Crinum, họ Thuỷ tiên
(Amaryllidaceae), bộ hành (Liliales), lớp hành (Liliopsida - lớp một lá mầm),
phân lớp hành (Liliidae), ngành hạt kín Magnoliophyta, giới thực vật [4].


Lá mọc từ thân hành, mỏng hình dải dài 60 - 90 cm, rộng 6 - 11 cm, mép lá l ợn sóng. Gân lá song song, mặt trên của lá lõm thành rãnh, mặt dới lá có một
sống lá nổi rất rõ. Gốc phẳng có bẹ lá ở nơi sát đất màu đỏ tím. Đầu lá nhọn hoặc
tù, lá bắc rộng hình thìa dài 7 cm, màu lục, đầu nhọn [3], [5], [19], [22].


Rễ

TNHC là loại sống địa sinh có hệ rễ chùm do rễ chính không phát triển. Rễ
to, có số lợng nhiều. Kích thớc của các rễ tơng đối đồng đều.


Hoa

Hoa hợp, mọc thành tán gồm 6 - 18 hoa trên một cán hoa dài 30 - 60 cm, có
bẹ hình tam giác màu xanh ve, dài từ 5 - 7 cm, cuống hoa ngắn. Cánh hoa màu
trắng pha hồng. Bao hoa hơi cong dài 7 - 10 cm, gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền
1/3 thành ống hẹp, khi nở đầu phiến quăn lại, nhị 6 bầu hạ. Bao phấn hình sợi dài


20 - 25 mm, đính lng, bầu hình ống chỉ, vòi nhị mảnh vợt lên trên nhị [3], [5], [7],
[9].


Quả

Quả có hình cầu, rất ít gặp. ở Việt Nam, cây không đậu quả.


Hạt

TNHC là một dợc liệu rất quan trọng trong sản xuất thuốc viên Crila. Đây là
sản phẩm 100% chiết suất từ lá cây TNHC. Việc bào chế ra Crila - viên tân d ợc
đầu tiên có khả năng ức chế sự phát triển của khối u đã đợc hội đồng các nhà
khoa học Việt Nam chấp nhận. Đây là tin vui cho các bệnh nhân bị phì đại tuyến
tiền liệt và u xơ tử cung. Khả năng điều trị phì đại tuyến tiền liệt của crila đạt
89,18% (2005) và u xơ tử cung đạt 79,5% (2007) [23], kết quả này đợc hội đồng
khoa học quốc gia kiểm nghiệm lâm sàng tại Việt Nam theo quy chế 371 của bộ y
tế. Crila có khả năng làm giảm thể tích tiết tiền liệt đồng thời cải thiện tiểu tiện và
tăng chất lợng cuộc sống của bệnh nhân. Trong kiểm nghiệm lâm sàng thể tích
khối u giảm 33% trong thời gian điều trị 60 ngày [25]. Loại thuốc này còn mở ra
hớng điều trị các bệnh nan y bằng phơng pháp kích thích hệ miễn dịch với các
loại sản phẩm có nguyên liệu từ các loại cây cỏ thiên nhiên và ít độc hại.
Nh vậy, TNHC không chỉ có tác dụng chữa các bệnh trong y học dân gian mà
nó còn có khả năng chống ung th và kích thích miễn dịch. Tất cả các công dụng
của TNHC đã và đang đợc các nhà khoa học khám phá nhằm đáp ứng nhu cầu
chữa các căn bệnh ung th - một trong những nhu cầu hàng đầu mà toàn thế giới
rất quan tâm.
1.1.4. Thành phần hoá học
Nhận thấy tác dụng dợc lý của TNHC, các nhà khoa học ở nhiều nớc đã tiến
hành nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính của nó chủ yếu từ năm 1980.
Bằng các phơng pháp thông thờng các nhà khoa học đã định tính sơ bộ các nhóm
hợp chất quan trọng có trong các bộ phận chính của cây TNHC nh các chất
alkaloid, saponin, axit hữu cơ và các chất chống oxi hoá [6]. Trong các hợp chất
đó thì alkaloid là nhóm chất rất quan trọng. Alkaloid là chất hữu cơ có tính kiềm,
có vị đắng. Các alkaloid thuộc hai nhóm là: dị vòng và không dị vòng.
Năm 1984, Ghosah đã phân lập và xác định từ cán hoa TNHC một
glucoalkaloid có tên là latisolin. Khi bị thuỷ phân bằng enzyme thu đợc aglycon
có tên là latisodin. Ghosal và Shibnath còn phân lập đợc từ thân hành lúc cây



ở Việt Nam thì không biết từ bao giờ, ngời dân đã thấy cây thuốc quý này
mọc hoang ven suối trong rừng ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số địa phơng
các tỉnh phía Nam. Và hiện nay, TNHC đã có mặt cả ở ba miền Bắc, Trung và
Nam. Trong đó đã xác định đợc vùng đất Long Thành (tỉnh Đồng Nai) là đất rất
thích hợp cho sự phát triển của TNHC. Bộ phận sử dụng là lá dùng tơi hay phơi
khô hoặc thái nhỏ dùng dần. ở các tỉnh phía Nam, TNHC đợc dùng phổ biến để
chữa bệnh đờng tiết liệu. Ngoài ra, ở Việt Nam nhân dân còn sử dụng TNHC làm
cây cảnh do hoa có màu sắc đẹp.
Tình hình sử dụng TNHC trong nớc và trên thế giới đòi hỏi phải có phơng
pháp nhân giống thích hợp đáp ứng đợc nhu cầu sử dụng của nhân dân. Trong đó
phơng pháp hữu hiệu nhất là phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật là phơng pháp sử dụng các điều kiện
nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào thực vật trong điều kiện in vitro. Mục đích
chung của NCMTB thực vật là sử dụng các điều kiện nh ánh sáng, nhiệt độ, thành
phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng... để điều khiển quá trình sinh trởng và
phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu đặt ra [14].
1.3.1. Vài nét về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
NCMTB thực vật đã hình thành từ vài thập kỷ trớc mà cơ sở của nó đợc bắt
đầu từ những thí nghệm đầu tiên của Harberlandt (1898 - 1902) khi ông đa các
giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm mọi cơ thể sinh vật phức
tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều
mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh
và là đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể [11]. Và
Harberlandt là ngời đầu tiên đề xớng ra tính toàn năng của tế bào (totipotency),
nghĩa là bất kỳ một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Tiếc thay,
các thí nghiệm của ông đã không thành công.
Năm 1922, Kotte và Robbins lập lại thí nghiệm của Harberlandt với đỉnh sinh


hình thành cơ quan thực vật.


Trong giai đoạn mới từ năm 1960 trở lại đây, cùng với việc NCMTB đơn, tế
bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đợc phát triển mạnh.
Các kỹ thuật lai tế bào soma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuật chuyển
gen đợc phát triển và thu đợc những thành tựu đáng kể.
ở nớc ta, NCMTB phát triển từ những năm 1980 và đạt đợc những kết quả
khích lệ trong nhân giống in vitro các cây khoai tây, cây hoa Phong lan, Hồng,
Cúc...; một số cây công nghiệp nh Bạch đàn, Keo; cây dợc liệu nh Thông đỏ,
TNHC... Đến nay, NCMTB thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của
CNSH hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, tạo
giống và nhân giống thực vật.
1.3.2. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
NCMTB thực vật ngày càng đợc hoàn thiện với nhiều kỹ thuật. Tuỳ theo mục
đích và đối tợng thực vật mà sử dụng kỹ thuật NCMTB thực vật cho phù hợp.
Theo quan điểm hiện nay, NCMTB thực vật bao gồm sáu kỹ thuật sau :


Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời:

Phơng pháp này để nghiên cứu điều kiện sinh trởng đối với một bộ phận hoặc
một mô của cây in vitro, tạo thành mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản nh
chọn dòng tế bào; đột biến xoma và ứng dụng phân hoá tế bào, cơ quan.


Nuôi cấy mô phân sinh:

Đợc dùng trong các trờng hợp tạo những giống cây sạch bệnh và nhân giống
in vitro; tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin và nghiên cứu quá trình hình

Nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào, ảnh hởng của các điều kiện khác nhau lên
quá trình sinh trởng, phát triển và phân hoá tế bào. Phơng pháp này đợc sử dụng
trong việc chọn dòng tế bào.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hởng tới nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự sinh trởng và phát trởng của thực vật in vitro đợc quy định bởi một số
nhân tố phức tạp nh: các yếu tố trong môi trờng; những yếu tố vật lý và các chất
điều hoà sinh trởng, các vitamin...
1.3.3.1. ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy
Môi trờng NCMTB thực vật có nhiều loại khác nhau nh môi trờng MS
(Murashige và Skoog), môi trờng Knop, Gamborg Tuy nhiên, các môi trờng
đều bao gồm các thành phần chính sau:


Đờng

Đờng là thành phần quan trọng trong môi trờng dinh dỡng. Các mô tế bào
thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phơng thức dị dỡng mặc dù ở nhiều
trờng hợp chúng có thể sống bán dị dỡng nhờ điều kiện chiếu sáng nhân tạo [1].
Đờng đợc sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lợng trong nuôi cấy, đồng
thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trờng [16]. Đờng thờng dùng
là Sacarose hàm luợng 2% - 8% [21]. Nếu sử dụng ở nồng độ cao hơn sẽ ức chế
sự sinh trởng phát triển của mô nuôi cấy [18]. Ngoài ra, các đờng khác nh
Maltose, Glucose, Fructose... ít đợc sử dụng.




Thành phần khoáng

Sau đờng, chất khoáng là nhóm dinh dỡng quan trọng không kém cho sự phát



ánh sáng


ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cờng độ, thành
phần quang phổ của ánh sáng [18]. Cờng độ ánh sáng thích hợp cho nhiều loại mô
trong giai đoạn tái sinh là 2000 - 3000 lux.


Nhiệt độ

Tuỳ thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy là khác nhau nhng nhiệt độ
thích hợp là 25 20C. Nhiệt độ này có ảnh hởng tích cực tới quá trình sinh trởng
và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy. Trong một số trờng hợp, nhiệt
độ lạnh lại có ảnh hởng tốt hơn chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 4 0C thì hiệu suất
tạo mô sẹo sẽ tăng [14]. Nhiệt độ cao còn ảnh hởng tới sinh trởng của các mô
nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc của các chất điều hoà sinh trởng thực vật
nh phân huỷ IAA và GA [21].


Độ pH

Độ pH ảnh hởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dỡng vào tế
bào. Giá trị pH thay đổi làm thay đổi chiều hớng và tốc độ của nhiều phản ứng
sinh hoá, quyết định hấp thụ cation và anion của tế bào, ảnh hởng đến áp suất
thẩm thấu của tế bào [12]. pH khoảng 5,5 - 6 là thích hợp với nhiều loại mô nuôi
cấy. Khi pH thấp sẽ hoạt hoá enzyme hydrolaza dẫn tới kìm hãm sự sinh tr ởng và
phát triển, đồng thời kích thích sự hoá già của tế bào [14].

kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh với
sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Nồng độ cytokinin thờng đợc sử dụng là 0,5
- 2mg/l. Nếu nồng độ thấp hơn thì biểu hiện hiệu quả kích thích kém, khả năng
tạo chồi giảm. Ngợc lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạt hoá hình thành chồi bất
định gây ra hiện tợng mọng nớc và kìm hãm quá trình tạo rễ.
Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có tác dụng
quyết định đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô nuôi cấy. Các tỷ lệ
auxin/cytokinin khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự phân hoá
của mô nuôi cấy. Nếu tỷ lệ này cao thì thích hợp cho hình thành rễ, còn thấp sẽ
hình thành chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển của
mô sẹo.
Ngoài auxin và cytokinin còn có nhiều chất điều hoà sinh trởng khác nh
Giberellin, etylen, axit ascorbic. Giberellin có tác dụng kích thích kéo dài tế bào
nhất là thân và lá. Etylen và axit ascorbic là chất ức chế sinh trởng có tác dụng
đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật [11].


ảnh hởng của vitamin


Vitamin là chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng enzyme. Mặc dù tất cả
các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp đ ợc hầu
hết các loại vitamin nhng thờng không đủ về số lợng do đó phải bổ sung thêm vào
môi trờng một số vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B nh vitamin B1, vitamin B2,
vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6. Trong đó vitamin B1 đợc coi là cần thiết nhất
đối với sự sinh trởng và phát triển của tế bào thực vật.
1.3.4. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro
Qua lịch sử phát triển lâu dài, đến nay nuôi cấy mô tế bào thực vật có rất
nhiều ứng dụng thực tiễn. Trong đó, nhân giống in vitro đợc coi là phơng pháp
hữu hiệu nhất. Nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế

tính có đặc điểm gần nh phôi hữu tính. Giai đoạn này thờng kéo dài 2 - 12 tháng.


Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện môi trờng nuôi cấy phải đợc tối u hoá nhằm đạt đợc
mục đích nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2
tháng tuỳ loài cây. Nhìn chung, giai đoạn 3 thờng đợc thực hiện trong 10 - 36
tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu.


Giai đoạn 4: Hình thành rễ

Khi đạt đến một kích thớc nhất định thì các chồi tái sinh đợc chuyển sang
môi trờng tạo rễ. Trong giai đoạn này, ngời ta thờng bổ sung vào môi trờng nuôi
cấy auxin có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Giai đoạn này thờng diễn ra
trong 2 - 8 tuần.


Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn cuối cùng của quy trình nhân giống in vitro. Cây con lấy từ
ống nghiệm ra phải đợc rửa sạch môi trờng bám vào rễ để tránh sự xâm nhập của
côn trùng và nấm mốc. Trong giai đoạn này, cần phải chăm sóc, bảo vệ cây trớc
những yếu tố bất lợi sau: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi khuẩn và nấm,
bị bệnh thối nhũn, cháy lá do nắng... Cần phải che phủ cây bằng nilon, tới, phun
sơng đảm bảo độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có thể là đất, mùn ca và bọt
biển. Giai đoạn này thờng đòi hỏi 4 - 16 tuần.
Với phơng pháp nhân giống in vitro, nuôi cấy mô thực vật đã góp một phần
rất lớn vào kết quả nghiên cứu của di truyền học, hoá sinh học, vi sinh học, thể



Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hởng của auxin đến khả năng tạo mô sẹo

Củ TNHC sau khi khử trùng đợc tách lấy các vẩy hành và cắt thành những
miếng nhỏ kích thớc 1 cm x 1 cm rồi cấy lên môi trờng có bổ sung NAA hoặc
2,4-D với các nồng độ khác nhau và đặt trong bóng tối. Môi trờng tạo mô sẹo có
bổ sung 30 g/l đờng + 8 g/l agar + NAA đợc ký hiệu là TN, môi trờng tạo mô sẹo
có bổ sung 2,4-D ký hiệu là TD với các công thức sau:
TN1= MS + 1 mg/l NAA

TD1= MS + 1 mg/l 2,4-D

TN2= MS + 1.5 mg/l NAA

TD2= MS + 1.5 mg/l 2,4-D

TN3= MS + 2 mg/l NAA

TD3= MS + 2 mg/l 2,4-D

TN4= MS + 2.5 mg/l NAA

TD4= MS + 2.5 mg/l 2,4-D

TN5= MS + 3 mg/l NAA

TD5= MS + 3 mg/l 2,4-D

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến

NK6= 1.5 mg/l NAA + 1 mg/l kinetin

NB7= 1.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP

NK7= 1.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l kinetin

NB8= 1.5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP

NK8= 1.5 mg/l NAA + 2 mg/l kinetin


Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến

khả năng tái sinh cây TNHC
Việc tái sinh để tạo chồi có thể tiến hành từ mô sẹo hoặc trực tiếp từ lõi củ
cây TNHC. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí hai thí nghiệm nhỏ.
Thí nghiệm 4.1: Tái sinh cây từ mô sẹo

Từ mô sẹo có thể phát sinh hình thái thành chồi trong điều kiện thích hợp.
Thí nghiệm đợc tiến hành trên môi trờng có bổ sung 100mg/l nc dừa và tổ hợp
các chất kích thích sinh trởng NAA, BAP hoặc kinetin có nồng độ phù hợp và
30g/l đờng, 8g/l agar. Môi trờng tạo chồi đợc ký hiệu là MB và MK với các công
thức nh sau:
MB1= 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP MK1= 0.5 mg/lNAA + 0.5 mg/l kinetin
MB2= 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP

MK2= 0.5 mg/l NAA + 1 mg/l kinetin

MB3= 0.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l BAP MK3= 0.5 mg/l NAA + 1.5 mg/l kinetin
MB4= 0.5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP


IR2 = MS/2 + 1 mg/l IBA
2.2.3. Các chỉ tiêu đánh giá


Đánh giá kết quả khử trùng

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100


Đánh giá kết quả tạo mô sẹo

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/Tổng số mẫu) x 100


Đánh giá kết quả nhân sinh khối mô sẹo

Tỷ lệ mô sẹo ra rễ (%)= (Số mô sẹo ra rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ mô sẹo hoá nâu (%)= (Số mô sẹo hoá nâu/Tổng mô sẹo đa vào) x 100


Đánh giá kết quả tái sinh cây từ mô sẹo
Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số mô sẹo tạo chồi/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ tạo rễ (%) = (Số mô sẹo tạo rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100
Tỷ lệ lục hoá (%) = (Số mô sẹo lục hoá/Tổng mô sẹo đa vào) x 100




Độ lệch chuẩn: S =



(Xi - X)2

X = X X

Trong đó: Xi là giá trị của từng số liệu
n: Số lần thí nghiệm; t( ,f) tra bảng với = 0.05; f = n -1

n -1


chơng 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Nghiên cứu hiệu qủa khử trùng
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, phơng pháp khử trùng là rất quan trọng, nó
quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Tuỳ theo sự tiếp xúc
của mẫu với môi trờng mà nó chứa nhiều hay ít mầm bệnh vi sinh vật nh nấm, vi
khuẩn Vì vậy cần phải có chế độ khử trùng hợp lý cho kết quả tốt nhất. Phơng
pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất là dùng các hoá chất có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật. Hoá chất đợc sử dụng làm chất khử trùng mẫu cần đảm bảo hai
đặc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không độc hoặc độc ở mức độ thấp
với thực vật. Chế độ khử trùng tốt nhất cần đảm bảo vô trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm
thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mẫu có khả năng phân hoá sinh trởng và phát triển tốt.
Đối với mẫu cây TNHC, chúng tôi sử dụng củ làm nguồn nguyên liệu để tái
sinh cây trong điều kiện in vitro. Trong thí nghiệm này, chúng tôi bố trí khử trùng
mẫu củ ở sáu chế độ với thời gian khử trùng bằng cồn 70% trong 30 - 60 giây.
Sau đó tráng nớc cất vô trùng 3 - 4 lần rồi khử trùng tiếp bằng javen 50% trong 5 10 phút. Cuối cùng tráng nớc cất vô trùng 4 lần.
Kết quả của chế độ khử trùng đợc trình bày ở bảng 1:

Tỷ lệ sống
(%)

5
7
10
5
7

56
78
79
58
70

17,85 2,05 6,31 0,54 75,84 2,83
87,0 5,21
1,33 0,26 11,70
4,98
1,27 0,13 31,24 3,65 67,49 4,01
1,15 0,05

28,52 5,63 70,33 5,61

10

89

1,12 0,04