BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG SỬ DỤNG ĐẠM TỪ HỆ TIÊU HÓA TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
HUỲNH NHƯ Ý
MSSV: 3102798
LỚP: CNSH K36TT

Cần Thơ, Tháng 5/2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2015

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp


LỜI CẢM TẠ
---------*--------Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, đặc biệt là những thầy cô thuộc Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giảng dạy kiến thức cho em trong suốt
quá trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu cán bộ hướng dẫn đề tài của em.
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn, cô đã giúp đỡ, truyền thụ kiến thức,
tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập, người đã luôn quan
tâm, chia sẻ, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cảm ơn bạn Nguyễn Trung Duẩn, Nguyễn Ngọc Thanh, tập thể lớp Công nghệ
sinh học tiên tiến khóa 36. Cảm ơn các cán bộ quản lý ở các phòng thí nghiệm đã tạo điều
kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài cũng như các anh chị đã nhiệt tình chia sẻ kiến thức
kinh nghiệm cho em hoàn thành tốt đề tài.
Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người
thân đã giúp đỡ em về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý thầy cô, anh chị cùng tất cả các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe và


Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
KÝ TÊN HỘI ĐỒNG .......................................................................................
CẢM TẠ ............................................................................................................
TÓM LƯỢC ..................................................................................................... i
MỤC LỤC .......................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ v
CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................vi
CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU ............................................................................. iv
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. - 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................. 1
1.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................. 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
2.1. Tổng quan về trùn quế ............................................................................. 3
2.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................... 3
2.1.2. Đặc tính sinh học của trùn quế ........................................................... 3
2.1.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế ............................................................. 4
2.1.4. Sự sinh sản và phát triển .................................................................... 5
2.1.5. Lợi ích của trùn quế ........................................................................... 5
2.2. Chu trình nitơ ........................................................................................... 6
2.2.1. Quá trình cố định đạm........................................................................ 7
2.2.2. Quá trình nitrate hóa .......................................................................... 8
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ sinh học

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................ 30
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa
trùn quế ..................................................................................................... 30
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm ..................... 30
4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập ........................................ 30
4.2. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite của
các dòng vi khuẩn đã phân lập ............................................................... 33
4.3. Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập
được .......................................................................................................... 38
4.4. Nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium,
nitrate và nitrite ...................................................................................... 41
4.4.1. Dựa vào khóa phân loại Bergey ....................................................... 41
4.4.2 Nhận diện bằng các kỹ thuật sinh học phân tử ................................ 41
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 46
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 52
Phụ lục 1. Kết quả ...................................................................................... 52
Phụ lục 2. Hình ảnh thiết bị ....................................................................... 60



Chuyên ngành Công nghệ sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1. Trùn quế (Perionyx excavatus) .......................................................... 3
Hình 2.2. Lợi ích của trùn quế ........................................................................... 5
Hình 2.3. Chu trình nitơ..................................................................................... 7
Hình 2.4. Vi khuẩn Pseudomonas ................................................................... 10
Hình 2.5. Vi khuẩn Bacillus firmus ................................................................. 12
Hình 3.1. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ..................................................... 28
Hình 4.1. Các dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được . 33
Hình 4.2. Biểu đồ kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi
trường dinh dưỡng tối thiểu lần lượt bổ sung NH4+, NO3-, NO2- với nồng
độ tăng dần....................................................................................................... 38
Hình 4.3. Kết quả nhuộm Gram ...................................................................... 39
Hình 4.4. Kết quả so sánh trình tự DNA của dòng R575 với ngân hàng
gen của NCBI bằng phần mềm BLAST .......................................................... 42
Hình 4.5. Kết quả so sánh trình tự DNA của dòng V411 với ngân hàng
gen của NCBI bằng phần mềm BLAST .......................................................... 43
Hình 1 phụ lục 2. Một số thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm .................. 60

dNTPs

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

LB

Loading Buffer

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

Taq


nitrate một cách hiệu quả thông qua sự phối hợp hoạt động của hai nhóm vi sinh vật, vi
khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee et al., 2002)
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa
trùn quế (Perionyx excavatus)” được tiến hành nhằm tìm ra những vi sinh vật có khả năng
sử dụng đạm trong hệ tiêu hóa của trùn quế để đưa vào ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi
trường.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ
tiêu hóa của trùn quế tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

-1-

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

1.3. Nội dung nghiên cứu.
Phân lập và khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả
năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế. Đánh giá khả năng sử dụng ammonium, nitrate
và nitrite của các dòng vi khuẩn phân lập được để tuyển chọn hai dòng vi khuẩn có khả
năng sử dụng các loại đạm tốt nhất với nồng độ tăng dần. Nhận diện hai dòng vi khuẩn
tuyển chọn được dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA và các đặc tính hình thái, sinh hóa.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học


hồng (tùy theo tuổi), màu đậm dần về phía hai đầu, bụng màu nhạt hơn. Cơ thể trùn có
hình thon dài, nhọn ở hai đầu, thân nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành
tơ. Khi di chuyển, lực đẩy được tạo ra từ nhờ vào sự co duỗi các đốt thân kết hợp với
các lông tơ phía dưới bám vào cơ chất khiến cơ thể di chuyển một cách dễ dàng
Bề ngoài của trùn quế được bao bọc bởi một lớp biểu bì mỏng màu đỏ, với các tế
bào chuyên biệt tiết chất nhầy để giữ ẩm cơ thể và dễ dàng di chuyển qua đất. Dưới da
là một lớp các mô thần kinh, hai lớp cơ bắp một lớp bên ngoài mỏng cơ trơn và một lớp
bên trong dày hơn là cơ dọc (Edwards và Bohlen, 1996). Trùn quế có một đường tiêu
hóa chạy thẳng từ miệng đến hậu môn.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

-3-

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

Trùn quế hô hấp qua da và mao mạch, chúng hấp thu O2 và thải CO2 trong môi
trường nước, điều này giúp trùn quế có khả năng sống trong thời gian dài. Ngoài ra,
nước và muối cũng có thể vận chuyển qua da bằng cách vận chuyển tích cực.
Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, ngoại trừ ba đốt đầu và những đốt
cuối cùng (Farabee, 2012), các cơ quan này giúp thực hiện chức năng bài tiết chất thải
dưới dạng urea và ammoniac. Sau đó, các chất thải này được đưa ra khỏi cơ thể nhờ vào
những lỗ chân lông trên bề mặt trùn quế.
Thức ăn vào miệng, cổ họng hoạt động như một máy bơm hút. Ruột của động vật có
vú thường cuộn lại trong khi ruột của trùn quế làm tăng diện tích bề mặt để tăng hấp thu
chất dinh dưỡng bằng nhiều nếp gấp chạy dọc theo chiều dài ruột (Edwards & Bohlen,

Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có cả cơ quan sinh dục đực lẫn sinh dục
cái. Đai và các lỗ sinh dục nằm ở đốt từ 9 – 15. Tuy nhiên, chúng không thể tự sinh
sản được, do đai sinh dục (tinh trùng và trứng) không chín cùng một lúc. Do đó,
chúng phải giao phối chéo với nhau để hình thành kén. Khi giao phối, hai cá thể
phải nằm ngược đầu với nhau, kén được tạo ra ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang
từ 2 – 20 trứng, kén trùn di chuyển dần về phía đầu và ra bên ngoài. Kén áo hình
dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu
trắng đục, sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt. Mỗi kén có thể nở từ 2 – 10
con. Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 –
7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một đường đỏ
thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 –30 ngày sau, trùn trưởng thành và bắt đầu xuất hiện
đai sinh dục từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản (Arellano et
al., 1995)
2.1.5. Lợi ích của trùn quế
Giảm ô nhiễm
môi trường

Phân hữu cơ
nông nghiệp

Trùn Quế

Thức ăn trong
chăn nuôi

Cải tạo đất

Hình 2.2. Lợi ích của trùn quế

Dựa trên những hoạt động sống của trùn quế mà chúng được sử dụng trực tiếp

thức ăn giàu dinh dưỡng trong nông, ngư nghiệp. Thức ăn chủ yếu của trùn quế là
phân trâu bò, lợn, gà, rác thải, rau củ quả, cây thân thảo và các loại rác hữu cơ hoại
mục,…sau khi thức ăn được trùn quế tiêu hóa sẽ thải ra ngoài thành phân và lượng
phân này có thể làm thức ăn trong chăn nuôi.
2.2 Chu trình nitơ
Nitơ phân tử là một nguyên tố chiếm phần lớn trong khí quyển với khoảng
78% thể tích, gấp 4 lần thể tích O2.
Nitơ cũng là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng đối với sinh vật, là thành phần
thiết yếu của protein, enzyme, các acid nucleic DNA và RNA, tham gia vào việc
tổng hợp các hợp chất cao năng như ATP và ADP,...

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

-6-

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 2.3 Chu trình nitơ
(http://kenpitts.net/bio/ecology/nitrogen_cycle.htm)

Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 3 dạng chủ yếu:
- Dạng chất hữu cơ: acid amin, protein,...
- Dạng hợp chất vô cơ: NH4+, NH3,...
- Dạng tự do: N2 trong không khí



Acid amin

Protein

2.2.2 Quá trình nitrate hóa (Nitrification)
Sự nitrate hóa là sự chuyển đổi từ ammonium (NH4+) thành nitrate (NO3-) bằng
hoạt động của các vi sinh vật. Quá trình này được thực hiện dưới tác động của hai
loại vi sinh vật trong hai giai đoạn bao gồm: chuyển hóa ammonium thành nitrite và
từ nitrite thành nitrate.
a. Chuyển hóa ammonium thành nitrite
Quá trình được thực hiện nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn oxy hóa
ammonium, các vi khuẩn này được sắp xếp theo nhóm phụ beta (Nitrosomonas,
Nitrosospira, Nitrosolobus) và gamma proteobacteria (Nitosococcus) (Purkhold et
al.,2003).
Cơ chế chuyển hóa ammonium thành nitrite gồm 2 phản ứng :

NH3 + O2 + 2H+
NH2OH + H2O

Ammonia monooxygenase

NH2OH + H2O

NO2 + 5H+

Phản ứng tổng quát:

Hydroxylamine oxydoreductase



NO2-

NO

N2 O

N2

Phản nitrate hóa còn bao gồm quá trình oxy hóa ammonium trong điều kiện kị
khí được gọi là ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation). Trong đó,
ammonium và nitrite sẽ được chuyển đổi trực tiếp thành nitơ phân tử (Mulder, 1989)
NH4+ + NO2-

N2 + 2H2O

3NH4+ + 2NO3-

5/2N2 + 6H2O

Hiện nay, quá trình phản nitrate hóa là một trong những biện pháp hữu hiệu hàng
đầu trong vấn đề xử lý nước thải và ô nhiễm môi trường.
2.2.4. Vi khuẩn khử đạm
Hầu hết các vi khuẩn khử nitrate đều là những vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc,
chỉ thực hiện quá trình khử nitrate trong điều kiện không có sự hiện diện của oxy
phân tử. Sản phẩm cuối cùng bao gồm nitrite (NO2-), ammonia (NH3-),
hydroxylamide (NH2OH) , nitric oxide (NO) hay nitơ phân tử (N2) tùy thuộc vào
từng loài sinh vật và điều kiện môi trường khác nhau (Trần Linh Thước, 2003).
Phương pháp truyền thống dùng để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ
tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng.

Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 - 370C. Vi khuẩn Pseudomonas
sp phân bố rộng rãi trong tự nhiên và rất đa dạng nhiều chủng loài. Một số loài
thuộc chi Pseudomonas có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, trong đó
nổi bật là Pseudomonas stutzeri và Pseudomonas aeruginosa.

Hình 2.4. Vi khuẩn Pseudomonas
(Nguồn:http://aquadomik.ru/bolezni-rybok-plavnikovaya-gnil/)

a. Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn khử đạm hình que không có sắc tố huỳnh
quang của chi Pseudomonas, được phân lập lần đầu bởi từ chất lưu xương sống
người. Khuẩn lạc không có hình dạng cố định, độ sệt thay đổi theo thời gian, dạng
sần, khô, bám chặt với nhau, đôi khi có màu vàng nhạt hoặc trắng đục.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

- 10 -

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

b. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc khả năng tiết ra nhiều
loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam hoặc lục), fluorescein (vàng lục) và pyorubin
(đỏ nâu). Tuy nhiên trong môi trường thiếu oxy nhưng có sự hiện diện của NO3làm chất nhận điện tử và nhiệt độ tối ưu thì chúng vẫn có thể phát triển được.
Khuẩn lạc của P.aeruginosa có 3 dạng tiêu biểu: (Trần Linh Thước, 2003)
+ Dạng nhỏ, thô (phân lập ở nhũng chuẩn hoang dại từ đất, nước)

2.3 Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử
2.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật được áp dụng trong sinh học
phân tử được Kary Mullius phát minh năm 1985. Kỹ thuật này cho phép các nhà
khoa học tạo ra hàng trăm nghìn bản sao từ 1 mẫu DNA ban đầu. Cơ chế của PCR
dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA từ mạch
khuôn. Bởi vì chỉ có thể gắn các nuleotide vào đầu 3’-OH nên DNA polymerase
cần các đoạn mồi để gắn nuleotide đầu tiên vào mạch khuôn. Đây là cơ sở để phân
định khu vực cần khuếch đại trong PCR.
Phản ứng PCR thường được tiến hành từ 35 – 40 chu kỳ.
* Những nguyên liệu cần thiết cho PCR:
-

Taq polymera

- Primer

-

Bi.H2O

- DNA khuôn

-

dNTPs

- MgCl2

-

+ Tm khoảng từ 55 – 80oC là thích hợp.
+ Có các thành phần nucleotide cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần GC.
+ Đặc hiệu cho sự khuếch đại trình tự DNA mục tiêu.
+ Tránh hiện tượng mồi tự bổ sung (khả năng tạo nên 2 cấu trúc hình kẹp tóc).
- dNTPs: bốn loại nucleotide được sử dụng tối ưu ở nồng độ 200 µM cho mỗi
loại. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide dễ gây ra lỗi trong quá trình
sao chép.
- Nồng độ MgCl2 ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả PCR. Nồng độ Mg2+ tối ưu cho
mỗi phản ứng PCR tùy thuộc vào những yếu tố khác nhau như Taq polymerase,
buffer và DNA mẫu.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

- 13 -

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36

Trường Đại học Cần Thơ

- Buffer: Hiệu suất và độ chính xác của Taq polymerase phụ thuộc nhiều vào
thành phần của buffer sử dụng, một số buffer đã chứa sẵn một lượng Mg2+
2.3.2 Kỹ thuật điện di DNA
Điện di DNA là một phương pháp trong sinh học phân tử nhằm sắp xếp các
đoạn DNA dựa trên đặc tính cấu trúc (chiều dài và điện tích). Do DNA tích điện
âm trên bề mặt nên khi bị tác động bởi một điện trường thích hợp chúng sẽ di
chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường.
Dung dịch đệm dùng trong kỹ thuật điện di thường là TAE, TE, TBE,....Hai
loại gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là agarose và polyacryamide: