ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

HUỲNH NGỌC OANH

NGHIÊN CỨU Q TRÌNH CỐ ĐỊNH
VÀ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ ENZYME
PHÂN GIẢI POLYSACCHARIDE

Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2010


i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Những kết quả trong nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố
bởi bất kỳ tác giả nào khác.
Huỳnh Ngọc Oanh



NCS Huỳnh Ngọc Oanh


iii

Mục lục
Lời cam đoan .......................................................................................................i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ............................................................vi
Danh mục các bảng ..........................................................................................vii
Danh mục hình ..................................................................................................xi
Danh mục sơ đồ ................................................................................................ xv
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
Chương 1- TỔNG QUAN .................................................................................. 4
1.1- Enzyme cố đònh ........................................................................................... 4
1.1.1- Sơ lược về enzyme cố đònh ...................................................................... 4
1.1.2- Các phương pháp cố đònh enzyme ........................................................... 7
1.1.3- Chất mang .............................................................................................. 14
1.2- Enzyme thủy phân carbohydrate .............................................................. 30
1.2.1- Enzyme - amylase............................................................................... 30
1.2.2- Glucoamylase-GA ................................................................................. 32
1.2.3- Cellulase................................................................................................ 34
1.2.4- Pectinase ................................................................................................ 35
Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 38
2.1- Vật liệu và hoá chất .................................................................................. 38
2.1.1- Enzyme thương mại................................................................................ 38
2.1.2- Hóa chất ................................................................................................ 39
2.2- Các phương pháp tiến hành thực nghiệm ................................................. 39



v

3.4.6- Sự cố đònh Pectinex theo phương pháp CLEA .................................... 117
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 120
Kết luận ......................................................................................................... 120
Đề nghò ........................................................................................................... 122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH....................................................................... 123
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 124
PHỤ LỤC


vi

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
acry

:

Acrylamide

alg

:

Alginate

AMG, GA

:


Cố đònh

CLEA

:

Cross-linked enzyme aggregates

CMC

:

Carboxymethyl cellulose

CP E

:

Chế phẩm enzyme

CT

:

Công thức

dd

:


Hoạt độ

HS

:

Hiệu suất

PEI

:

Polyethylenimine

pp

:

Phương pháp

tb

:

Trung bình

td

:

Danh mục các bảng

Bảng 1.1: Khả năng chòu nhiệt của các enzyme tự do và enzyme dạng CLEA11
Bảng 1.2: Kết quả hoạt độ và hiệu quả cố đònh của lipase lên các chất mang28
Bảng 2.1: Tiến hành khảo sát các enzyme cố đònh và chất mang trong thực
nghiệm ............................................................................................................53
Bảng 2.2: Khảo sát các thông số và giá trò biểu thò trong thực nghiệm ..........53
Bảng 3.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Termamyl trên
alginate ...........................................................................................................55
Bảng 3.2: nh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh ......56
Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ alginate, CMC đến khả năng cố đònh enzyme 58
Bảng 3.4: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên
CMC-alginate ................................................................................................59
Bảng 3.5: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Termamyl cố
đònh. ...............................................................................................................60
Bảng 3.6: Khả năng phân cắt một số cơ chất bởi dạng Termamyl cố đònh trên
gel CMC- alginate ..........................................................................................61
Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất cố đònh Termamyl trên BC và chitosan ............62
Bảng 3.8: nh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất cố đònh Termamyl trên
BC-chitosan ...................................................................................................63
Bảng 3.9: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên BCchitosan ...........................................................................................................64
Bảng 3.10: nh hưởng tỉ lệ acrylamide, bis acrylamide đến hiệu suất cố đònh
Termamyl trên polyacrylamide ......................................................................65


viii

Bảng 3.11: nh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên
polyacrylamide .............................................................................................. 66
Bảng 3.12: Khảo sát phương pháp hoạt hóa celite .........................................67

Bảng 3.29: nh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft cố đònh trên
polyacrylamide ..............................................................................................91
Bảng 3.30: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Cellusoft theo
phương pháp CLEA ........................................................................................92
Bảng 3.31: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến sự cố đònh Pectinex ...............94
Bảng 3.32: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
alginate ...........................................................................................................95
Bảng 3.33: Ứng dụng pectinase cố đònh trong xử lý dòch chanh dây .............96
Bảng 3.34: Một số yếu tố nh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
chitosan ..........................................................................................................98
Bảng 3.35: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
dạng phức chitosan bọc alginate...................................................................100
Bảng 3.36: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh
trên chitosan bọc alginate.............................................................................100
Bảng 3.37: So sánh hiệu suất cố đònh Pectinex trên dạng phức chất mang
chitosan-alginate .........................................................................................101
Bảng 3.38: Ảnh hưởng thời gian cố đònh và kích thước tạo hat gel đến hiệu
suất cố đònh Pectinex trên chitosan-carrageenan ........................................102
Bảng 3.39: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng
Pectinex cố đònh trên chiosan-carrageenan .................................................103
Bảng 3.40: nh hưởng tỉ lệ bis : acrylamide và tỉ lệ enzyme đến hiệu suất cố
đònh Pectinex ................................................................................................104


x

Bảng 3.41: Ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất cố đònh
Pectinex trên celite ......................................................................................108
Bảng 3.42: Ảnh hưởng một số yếu tố đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
celite ............................................................................................................109

Hình 1.16: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và thực vật ..............................19
Hình 1.17: CMC trong dung dòch AlCl3 .......................................................20
Hình 1.18: Cấu tạo của carrageenan ...........................................................21
Hình 1.19: Sự tạo chitosan bằng quá trình deacetyl hóa chitin ...................22
Hình 1.20: Quá trình polymer hóa của polyacrylamide ..............................24
Hình 1.21: Một vài chất mang vô cơ thông dụng trong cố đònh enzyme .....25


xii

Hình 1.22: Cấu trúc chất mang silica gel .....................................................27
Hình 1.23: Sự hình thành nhóm hydroxyl diễn ra trên bề mặt của silica gel 27
Hình 1.24: Vò trí tấn công của -amylase ...................................................30
Hình 1.25: -amylase từ các nguồn khác nhau ...........................................31
Hình 1.26: Vò trí phân cắt tinh bột bằng -amylase và GA .........................32
Hình 1.27: Enzyme GA từ các nguồn khác nhau ..........................................33
Hình 1.28: Sự tác động của phức hợp cellulase lên cellulose ......................34
Hình 1.29: Cấu trúc phân tử enzyme -1,4-D-Glucanohydrolase ................34
Hình 1.30: Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-PG II của Asp. niger ........36
Hình 1.31: Enzyme polygalacturonase từ các nguồn khác nhau .................36
Hình 2.1: Quá trình tạo hạt gel calcium alginate nhốt enzyme ...................45
Hình 3.1: Hạt gel bảo quản ở 50oC và nhiệt độ phòng ................................54
Hình 3.2: Lượng maltose tạo thành theo thời gian phản ứng bởi dạng
Termamyl cố đònh trên alginate .................................................................. 57
Hình 3.3: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố đònh trên alginate .........57
Hình 3.4: Termamyl cố đònh lên gel CMC- alginate ...................................58
Hình 3.5: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên CMCalginate ........................................................................................................61
Hình 3.6: Hạt gel chitosan ...........................................................................62
Hình 3.7: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên BC-chitosan
......................................................................................................................64

Hình 3.26: Khả năng tái sử dụng của dạng Cellusoft cố đònh trên
polyacrylamide ............................................................................................91
Hình 3.27: Khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố đònh dạng CLEA .......... 93
Hình 3.28: Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh
trên alginate .................................................................................................95
Hình 3.29: Khả năng phân cắt pectin trong nước chanh dây bởi pectinase 96
Hình 3.30: Khả năng phân cắt pectin trong dòch nho bởi Pectinex cố đònh..96


xiv

Hình 3.31: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên alginate 97
Hình 3.32: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên chitosan bọc
alginate .......................................................................................................101
Hình 3.33: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên chitosancarrageenan ...............................................................................................103
Hình 3.34: Hạt gel Pectinex cố đònh trên polyacrylamide .........................105
Hình 3.35: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ...........................................................................................105
Hình 3.36: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ...........................................................................................106
Hình 3.37: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ..........................................................................................106
Hình 3.38: Khả năng phản ứng liên tục bởi dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ..........................................................................................107
Hình 3.39: Pectinex cố đònh trên celite .....................................................108
Hình 3.40: So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ dạng
Pectinex cố đònh và tự do trên celite .........................................................110
Hình 3.41: So sánh ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố
đònh và tự do trên celite .............................................................................110
Hình 3.42: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên celite .. 111

Sơ đồ 2.17: Cố đònh enzyme trong quá trình taọ mạng silica gel và alginate .... 50
Sơ đồ 2.18: Các bước hoạt hóa silica gel ............................................................. 50
Sơ đồ 2.19: Cố đònh enzyme trên silica gel đã hoạt hoá .................................... 51
Sơ đồ 2.20: Cố đònh enzyme theo phương pháp CLEA ...................................... 51


1

MỞ ĐẦU

Trong tế bào sống của sinh vật luôn xảy ra các quá trình chuyển hóa hết sức
phức tạp và luôn theo những qui luật nhất đònh. Các quá trình chuyển hóa này
đều được thực hiện và điều khiển bởi rất nhiều enzyme khác nhau. Enzyme
không chỉ tham gia các phản ứng hóa học trong tế bào mà còn thực hiện các phản
ứng ngoài tế bào. Các enzyme được khai thác và ứng dụng ngày càng rộng rãi
trong đời sống và sản xuất. Những sản phẩm tạo thành từ polysaccharide bởi sự
xúc tác của nhóm enzyme thủy phân polysaccharide có một giá trò thực tiễn rất
lớn. Chính vì thế, đã từ lâu loài người đã biết sử dụng chúng trong sản xuất rượu
bia, tương , chao … Việc nghiên cứu nhóm enzyme này vẫn được tiến hành ở
nhiều nước vàø ứng dụng trong nhiều lónh vực khác nhau.
Một trong những hướng nghiên cứu về enzyme đang được phát triển mạnh
là nghiên cứu cố đònh chúng trên các chất mang nhằm tăng khả năng ứng dụng, từ
đó làm tăng giá trò kinh tế của enzyme. Phần lớn các enzyme khi tách khỏi tế bào
thường tồn tại ở trạng thái tự do, hòa tan trong nước. trạng thái này chúng rất
dễ bò phá hủy dưới tác động của các yếu tố bên ngoài như pH, nhiệt độ và các
yếu tố khác. trong tế bào, chúng được bảo vệ bởi cả một hệ thống vật chất và
các cơ quan như mạng vi sợi, vi ống... Bao quanh là màng nguyên sinh chất,
thành tế bào. Dựa trên những hiện tượng tự nhiên đó, các nhà khoa học đã tìm ra
được nhiều phương pháp khác nhau để cố đònh enzyme tự do. Cố đònh enzyme là


3

năng cố đònh của 4 enzyme thuộc nhóm thủy phân carbohydrate trên các chất
mang khác nhau và khảo sát một số đặc tính của enzyme dạng cố đònh tạo được.
Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi đã đưa ra những nội dung nghiên cứu
cần thực hiện như sau:
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố đònh các enzyme: amylase, glucoamylase, cellulase và pectinase - trên nhiều loại chất mang khác
nhau: hữu cơ và vô cơ, tự nhiên và tổng hợp, dạng kết hợp để làm chất mang cố
đònh enzyme. Từ đó đưa ra những kỹ thuật cố đònh cho mỗi enzyme trên mỗi chất
mang cố đònh
- Xác đònh một số đặc tính của enzyme cố đònh thông qua một số yếu tố: t0,
pH… điều kiện bảo quản, khả năng tái sử dụng và ứng dụng qua hệ thống cột
phản ứng
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cố gắng làm rõ một số điểm mới
trong những nghiên cứu trước đây như:
- Mỗi enzyme có khả năng cố đònh trên các vật liệu khác nhau.
- Mỗi vật liệu làm chất mang có khả năng cố đònh enzyme khác nhau. Mỗi
một vật liệu đều có tính chất rất riêng biệt mà thiên nhiên “ban tặng” và chúng ta
có thể sử dụng trong nhiều lónh vực khác nhau trong đó có lónh vực sinh học.
+ Vật liệu vô cơ ‘háo nước’ như celite, silica gel là rất có tiềm năng để cố
đònh enzyme
+ Vật liệu ghép: kết hợp vật liệu vô cơ và hữu cơ, “layer by layer” đã cải
thiện được một số tính chất của enzyme cố đònh trong môi trường phản ứng
- Kết hợp nhiều kỹ thuật cố đònh để tăng hiệu suất cố đònh enzyme như kết
hợp bẫy, nhốt và liên kết, kết hợp hấp phụ và liên kết… và có một số thành công
khi sử dụng kỹ thuật CLEA tạo liên kết chéo giữa các enzyme.


4


Nhược điểm: Hoạt tính của enzyme cố đònh thường nhỏ hơn hoạt tính của
enzyme hòa tan cùng loại, do khi enzyme gắn vào chất mang cấu trúc của
enzyme có thể thay đổi ở mức độ nhất đònh. Do sự thay đổi cấu trúc không gian
của enzyme có thể làm cho sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản
ứng xảy ra yếu hơn. Hoặc do khi ta nhốt enzyme vào trong gel, gel sẽ bao lấy
enzyme tạo thành vật cản đối với cơ chất, vì vậy sự tiếp xúc giữa cơ chất và trung
tâm hoạt động của enzyme gặp khó khăn hơn so với enzyme tự
do.[9],[18],[39],[82]
1.1.1.3- Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố đònh
Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của
chất mang: tính chất vật lý (tính hòa tan, tính bền, độ trương, tính ưa nước hay kỵ
nước) và bản chất hóa học của chất mang đều có ảnh hưởng đến khả năng liên
kết, tính bền, hoạt tính sinh học của enzyme cố đònh. Enzyme cố đònh thường bền
nhiệt so với enzyme tan, chất mang cũng có tác dụng làm giảm sự biến tính của
enzyme. [9],[18]


6

Khi bò giới hạn trong không gian nhất đònh, sẽ có nhiều kiểu tương tác khác
của chất mang polymer lên môi trường bao xung quanh phân tử enzyme cố đònh:
 Kiểu thứ nhất: chất mang nhờ các tính chất đặc trưng của mình sẽ kéo hoặc
đẩy các cơ chất, sản phẩm và các chất khác sẽ làm thay đổi nồng độ các
chất ở môi trường vi mô sát với enzyme.
 Kiểu thứ hai: chất mang ngăn cản sự khuếch tán tự do theo hướng đến cũng
như đi khỏi enzyme làm thay đổi hiệu quả xúc tác của enzyme.
- Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm
và các chất khác. Tốc độ khuếch tán phụ thuộc vào các yếu tố:
 Kích thước lỗ gel của chất mang polymer
 Trọng lượng phân tử của cơ chất

mang

Phương pháp nhốt
enzyme

Tạo liên kết
chéo
(crossing)

Các phương pháp cho
enzyme không hòa tan

Tạo dẫn xuất

Không dẫn
xuất

Nhốt enzyme trong khuôn gel
(gel entrapment)
Nhốt enzyme trong hệ sợi
(fiber) entrapment)

Hấp phụ vật lý
Liên kết ion
Liên kết kim loại
Liên kết đồng hóa trò

Tạo vi nang
(microapsulation)


Nhốt phân tử enzyme trong mạng lưới polymer mà không có liên kết đồng
hóa trò giữa chất mang và phân tử enzyme. Trong các chất mang vô cơ thì chỉ có
silica gel là áp dụng được phương pháp này. Kỹ thuật sol-gel dựa trên mạng lưới
silica nhờ sự tham gia của tiền chất ban đầu (như Na2SiO3). Trong phương pháp
này người ta có thể bổ sung các chất hữu cơ để thúc đẩy sự trùng ngưng như
polypeptide,

polyamine,

polyamine.[72],[97], [99]

dẫn

xuất

polypeptide

hoặc

dẫn

xuất


9

1.1.2.2- Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang
a- Phương pháp hấp phụ

Hình 1.4: Enzyme hấp phụ lên chất mang [54]