ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LƯU NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP VÀ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS Ô NHIỄM TRONG
THỊT LỢN BÁN TẠI MỘT SỐ CHỢ Ở BẮC GIANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ THÚ Ý

THÁI NGUYÊN, NĂM 2013


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LƯU NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP VÀ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS Ô NHIỄM TRONG
THỊT LỢN BÁN TẠI MỘT SỐ CHỢ Ở BẮC GIANG
Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SỸ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐẶNG XUÂN BÌNH


và thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các cô chú anh, chị, em Bộ môn công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học, tập thể Phòng Nông nghiệp, Trạm Thú y 2 huyện
Tân Yên và Yên Thế trên địa bàn tỉnh Bắc Giang và các bạn đồng nghiệp đặc
biệt là gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi trong quá trình
hoàn thành luận văn này.
Thái nguyên, ngày

tháng 11 năm 2013

Tác giả luận văn

Lưu Ngọc Tuấn


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN...............................................................................................................ii
MỤC LỤC....................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................x
MỞ ĐẦU........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn.....................................................................................................2

Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................38
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu..............................................................................38
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................38
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu .........................................................................................38
2.2.3. Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn ........................................................38
2.2.4. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu......................................................................38
2.2.4.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm......................................................................38
2.2.4.2. Hóa chất thí nghiệm .......................................................................................39
2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm.............................................................................................41
2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................41
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm....................................................................41
2.3.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi......41


v

2.3.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt
lợn tươi ..........................................................................................................................42
2.3.4. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và
hoá dược của các chủng vi khuẩn Salmonella và Staphylococcus aureus
phân lập được .............................................................................................................44
2.3.5. Các phương pháp xác định trình tự DNA và nhân dòng, xác định gen liên
quan đến độc tố enterotoxin của Staphylococcus aureus.........................................45
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................48
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................49
3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm một số loại vi khuẩn trong thịt lợn tươi tại một số chợ ở
Bắc Giang......................................................................................................................49
3.1.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn nhiễm trên thịt lợn tươi tại một số chợ ở
Bắc Giang....................................................................................................................49

3.5.2. Kết quả tách DNA tổng số của vi khuẩn Staphylococcus aureus.................70
3.6. Đề xuất biện pháp phòng khống chế ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm vi khuẩn..72
KẾT LUẬN .................................................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................75
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI ............................................81
PHỤ LỤC ....................................................................................................................83


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

NĐTP

: Ngộ độc thực phẩm

VSATTP

: Vệ sinh an toàn thực phẩm


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tính chất mẫn cảm của các hemolysine do Staphylococcus aureus
sản sinh............................................................................................ 21
Bảng 3.1: Kết quả xác định vi khuẩn Salmonella spp nhiễm trên thịt lợn tươi......49

Biều đồ 3.4: Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus trên thịt tươi theo
thời gian ................................................................................. 57
Biều đồ 3.5: Chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp trên thịt tươi theo mùa vụ ... 59
Biều đồ 3.6: Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus trên thịt lợn tươi theo
mùa vụ............................................................................................. 62


x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Minh họa các bước lấy mẫu, xét nghiệm ...................................................... 41
Hình 2.2. Chu trình phản ứng PCR ....................................................................................... 47
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số ............................................ 70
Hình 3.2: Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số ............................................ 71


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Thực phẩm nói chung và thực phẩm có nguồn gốc động vật nói riêng là
thứ thiết yếu trong cuộc sống hàng ngày của con người. Cùng với sự phát
triển của nền kinh tế và đời sống của con người được cải thiện, nâng cao đòi
những loại thực phẩm có chất lượng cao nên vấn đề vệ sinh an toàn thực
phẩm được sự quan tâm hàng đầu. Việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm có
nguồn gốc động vật cần phải được thực hiện chặt chẽ từ khâu chọn giống, chăn
nuôi, tiêm phòng, chất lượng thức ăn chăn nuôi đến khâu giết mổ, vận chuyển,
bảo quản và chế biến đúng theo tiêu chuẩn vệ sinh thú y nhằm tạo ra sản phẩm
sạch phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của người dân.
Thịt gia súc, gia cầm là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, trong thịt

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella spp và
Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp tư liệu khoa học về loài Salmonella spp và Staphylococcus
aureus.
- Thiết lập cơ sở khoa học xác định đặc điểm dịch tễ có liên quan đến
ngộ độc thực phẩm do Salmonella spp và Staphylococcus aureus, từ đó đề
xuất biện pháp khống chế ô nhiễm thịt lợn.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Bổ sung tư liệu khoa học về tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô
nhiễm Salmonella và Staphylococcus aureus nói riêng trong thịt lợn tươi.
- Đề xuất biện pháp phòng, chống ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn.


3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ngộ độc thực phẩm
Theo Lã Quý Đôn và cs, (2008) [10], ngộ độc thực phẩm là do thức ăn
bị ô nhiễm bẩn mà tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, nấm mốc, ký sinh trùng,
siêu vi trùng, thường là do vi khuẩn (Microbial Food- borne Diseases), thực
vật và vi khuẩn biển cũng dễ gây ra bệnh lý thức ăn bị nhiễm khuẩn.
Bệnh này thường xảy ra một cách đột ngột, hàng loạt (nhưng không
phải là dịch), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính. Biểu hiện bệnh
thường là nôn mửa, tiêu chảy (riêng trường hợp nhiễm độc tố của vi khuẩn
độc thịt thì bị táo bón) và các triệu chứng khác đặc hiệu cho từng loại ngộ độc
như: chóng mặt, sốt, đau bụng và có thể dẫn đến tử vong.

Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là do ăn, uống thực phẩm
đã bị nhiễm khuẩn hoặc bị ô nhiễm hóa học (kim loại nặng, độc tố vi nấm...).
Các vi khuẩn, virus hoặc độc tố, dịch tiết của chúng là nguyên nhân
phổ biến nhất của ngộ độc thực phẩm. Các loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn cho
thực phẩm có thể tồn tại ở khắp mọi nơi trong không khí, đặc biệt khi thời tiết
nắng nóng hay giao mùa cũng làm các vi khuẩn trong thức ăn phát triển
nhanh hơn.
Ở nước ta những năm gần đây các ca NĐTP có chiều hướng gia tăng
mà nguyên nhân chính là do các nguồn thực phẩm hay nước uống bị ô nhiễm.
Các thực phẩm có nguồn gốc động vật có xu hướng dễ bị nhiễm khuẩn hơn.
Nhiễm độc thực phẩm có thể chia làm hai loại: Nhiễm độc do hoá chất và
nhiễm độc do các yếu tố sinh vật. Trong đó nguyên nhân do vi sinh vật
thường chiếm tỷ lệ tương đối cao, nhưng tỷ lệ tử vong lại thấp, ngược lại ngộ
độc do các nguyên nhân khác chiếm tỷ lệ thấp nhưng tỷ lệ tử vong lại cao. Vi
sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ô nhiễm, mất an toàn thực phẩm và có tới gần


5

50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong nhóm vi sinh
vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus,
Clostridium botulinum, E. coli và Listeria là đáng sợ nhất.
Trong điều kiện bình thường vi sinh vật sẽ phát triển, sinh sôi nảy nở
trên bề mặt của thịt rồi dần dần tiến sâu vào các lớp bên trong của thịt, làm hư
hỏng thịt. Tốc độ lan rộng và thấm sâu của vi khuẩn vào thịt phụ thuộc vào
nhiệt độ, độ ẩm của thịt và loài vi khuẩn (Nguyễn Vĩnh Phước, (1980) [18]).
Những loại vi khuẩn trên bị tiêu diệt ở nhiệt độ từ 630C trở lên, do đó
nên dùng thức ăn chín (nấu lâu ít nhất là 10 phút).
* Thực trạng ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới
- Ở Việt Nam

ra trong trường học do nhiễm Staphylococcus aureus. Trong đó, có 31 em tại
trường tiểu học Âu Cơ và 44 em tại trường mầm non Vườn Hồng.
Trong năm 2008, trên toàn quốc đã xảy ra 205 vụ ngộ độc thực
phẩm làm 7.828 người mắc và 61 người tử vong. Có 76,20% số tỉnh/thành
phố (48/63 tỉnh) xảy ra các vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó tỷ lệ mắc cao
nhất thuộc khu vực Đông Nam Bộ (chiếm 41,4%), số người tử vong nhiều
thuộc khu vực miền núi phía Bắc với tỷ lệ 42,6%, tiếp đến là Đồng bằng
sông Cửu Long với 41% tổng số ca chết do ngộ độc.
Trong năm 2009 cả nước có 116 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 6
vụ do nhiễm Staphylococcus aureus. Đáng chú ý vào tháng 7 năm 2009 tại
tỉnh Hải Dương đã xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể do nhiễm Staphylococcus
aureus, số người bị ngộ độc trong vụ này lên tới 258 người.
Theo báo cáo của Cục an toàn vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y tế, tình hình
ngộ độc thực phẩm trong năm 2010 diễn biến phức tạp, cả nước xảy ra 175 vụ
ngộ độc (trong đó có 34 vụ ngộ độc hàng loạt trên 30 người) xảy ra tại 47
tỉnh/thành phố, làm 5.664 người mắc và 42 trường hợp tử vong. Khu vực miền


7

núi phía Bắc có số vụ ngộ độc cao nhất (32.6%), tiếp đến là Tây Nguyên (12%),
miền Trung (11.4%), miền Đông Nam bộ (10.3%) và thấp nhất là đồng bằng
Bắc bộ (4.6%). Thời gian xảy ra ngộ độc thực phẩm cao nhất vào mùa hè (tháng
5 - 9), chiếm trên 70% số ca mắc và tử vong do ngộ độc thực phẩm trong năm.
- Trên thế giới
Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng
70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm.
Mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40.000 người là nạn nhân của vi khuẩn
Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần. Số người tử vong
vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người. Hầu hết số người bị vi

Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng
48.000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus).
Ước tính có khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005.
Tại các nước châu Á Staphylococcus aureus là nguyên nhân hàng đầu gây
ra các vụ ngộ độc chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực
Đông Nam Á.
Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc Staphylococcus
aureus ở trẻ em vì uống sữa bị nhiễm Staphylococcus aureus. Còn ở Nhật cũng
đã có 2 vụ ngộ độc Staphylococcus aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ
độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006
làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này
đều do họ đã uống sữa có nhiễm Staphylococcus aureus của tập đoàn Snow.
Trong khu vực Đông Nam Á 2 quốc gia có tỷ lệ ngộ độc Staphylococcus
aureus cao là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những nước
có tỷ lệ nhiễm Staphylococcus aureus cao ở trong khu vực châu Á.


9

Còn ở châu Âu thường nhiễm Staphylococcus aureus từ các bệnh viện,
tỷ lệ nhiễm Staphylococcus aureus chiếm 7% trong các vụ nhiễm khuẩn huyết
tại bệnh viện. Ở các vụ nhiễm khuẩn huyết ở Anh thì nhiễm khuẩn do MRSA
chiếm đến 96%.
1.3. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella và Staphylococcus aureus
1.3.1. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella
Salmonella được phát hiện lần đầu tiên năm 1885 bởi Salmon và Smith
là Salmonella choleraesuis. Năm 1934 chính thức được đặt tên là Salmonella.
Đến nay đã phát hiện hơn 2.000 serotype Salmonella khác nhau, có khả
năng gây bệnh, gây ô nhiễm thực phẩm cho cả người và động vật.
1.3.1.1. Hình thái và tính chất bắt màu

nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S. Nếu để lâu (quá 24 giờ),
màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần đáy ống nghiệm
(không nhìn thấy màu vàng). Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi đẩy
thạch khỏi đáy ống nghiệm (Quinn và cs, (2002) [47]).
Môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển
màu môi trường màu tím nhạt. Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát
triển nên không làm thay đổi màu môi trường.
1.3.1.3. Sức đề kháng
Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và
máu lạnh (các loài cá, động vật thuỷ sản), trong môi trường tự nhiên, phân,
đất, nước thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt
xương, bột trứng, bột cá… tồn tài được 9 tháng hoặc lâu hơn. Salmonella
sống trong thịt ướp muối 29% được 4 - 8 tháng ở nhiệt độ 6 - 120C.
- Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, ở 500C bị diệt sau 1h,
700C trong 20 phút, sôi 1000C sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp
Pasteur cũng diệt được vi khuẩn.
- Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nước
trong và 9h ở nước đục.


11

- Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: axid phenic
5%, formol 0,5% diệt khuẩn sau 15-20 phút.
1.3.1.4. Đặc tính sinh hóa
Theo Quinn và cs, (2002) [47], giống vi khuẩn Salmonella được chia
thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường
nhất định và không đổi. Phần lớn phân loài Salmonella enterica subsp.
enterica gây bệnh cho động vật máu nóng. Chúng lên men và sinh hơi:
Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol. Cũng ở

- Kháng nguyên K: Là kháng nguyên vỏ gồm 3 loại kháng nguyên là
kháng nguyên 5, kháng nguyên Vi và kháng nguyên M
+ Kháng nguyên Vi: Có sức đề kháng cao với cồn và axid HCl. Kháng
nguyên Vi không liên quan gì đến độc lực của vi khuẩn nhưng lại đóng vai trò
trong việc tạo miễn dịch chủ động và thụ động ở người và động vật.
+ Kháng nguyên 5: Dễ bị axid HCl phá huỷ và tính chất ngưng kết của
kháng nguyên 5 hoàn toàn bị phá huỷ ở nhiệt độ 1200C, nhưng không bị phá
huỷ bởi cồn.
+ Kháng nguyên M: là kháng nguyên của dòng vi khuẩn có khuẩn lạc nhầy.
1.3.1.6. Yếu tố gây bệnh
* Yếu tố bám dính
Fimbriae được xác định là yếu tố bám dính của vi khuẩn Salmonella. Đó
là một dạng Protein phân cực, có cấu trúc bậc 1 bao gồm nhiều đơn vị xác định,
có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử. Fimbriae có trọng lượng phân tử từ
8000 - 28000 dalton. Trong thành phần cấu tạo của Fimbriae có khoảng 50% là
các axid amin không phân cực. Chức năng của Fimbriae là tạo điều kiện cho vi
khuẩn Salmonella xâm nhập vào đường tiêu hoá và phân tán ra môi trường.
Trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250 - 400 fimbriae, chúng
giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh (Lê Văn
Tạo, (1993) [25]).


13

* Độc tố đường ruột (enterotoxin)
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính:
Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố
thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peteron, (1980) [45]).
+ Theo Clarke và cs (1988) [41], độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc
thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat-stabile