ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------------------------------

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

luËn v¨n th¹c sÜ sinh häc

Thái Nguyên: 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------------------------------

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

học Thái nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN và các thầy cô giáo, cán
bộ trong khoa đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện
của Ban giám hiệu Trường Đại học Hùng Vương, Ban chủ nhiệm khoa Nông
– Lâm – Ngư, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.
Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan……………………………………………………….........

i

Lời cảm ơn………………………………………………………………

ii

Mục lục……………………………………………………………….....

iii



5

1.1.4.Đặc điểm hóa sinh hạt ngô………………………………...............

7

1.1.5.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam………............

8

1.1.5.1.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới……………………….........

8

1.1.5.2.Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam…………………………......

12

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở
THỰC VẬT………………………………….........................................

13

1.2.1.Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
quan hệ di truyền thực vật……………………………….........................

13

1.2.1.1.Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms


1.3. NHẬN XÉT CHUNG……………………………………...............

24

Chƣơng 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………...... 25
2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………………………………………..

25

2.1.1.Vật liệu thực vật…………………………………………………...

25

2.1.2.Hoá chất…………………………………………………...............

25

2.1.3.Thiết bị……………………………………………………….........

26

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………...

26

2.2.1.Phương pháp hóa sinh……………………………………………..

26


CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN..............

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................... 52


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều
dài các phân đoạn được nhân bản)

ASTT

Áp suất thẩm thấu

CS

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA

SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SDS-PAGE Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS
SSR

Simple Sequence Repeats

STS

Sequense Tagged Site

TBE

Tris - Boric acid - EDTA

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan



năm 2007…………………………………………………

11

1.5

Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006 13

2.1

Đặc điểm 14 giống ngô nghiên cứu………………………...

2.2

Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong

25

nghiên cứu………………………………………………….

29

2.3

Thành phần phản ứng RAPD……………………………….

30

3.1


48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1

Hình dạng hạt của 14 giống ngô…………………………..

32

3.2

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 14 giống ngô…………

35

3.3

Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm.

37

3.4



3.9

41

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14
giống ngô………………………………………………….

3.8

40

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14
giống ngô………………………………………………….

3.7

39

44

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi UBC23 của 14
giống ngô………………………………………………….

46

Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 14 giống ngô………

49






SSR, STS, RAPD,... Các phương pháp này khắc phục được nhược điểm của
các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây
trồng.
Những năm gần đây, diện tích trồng các giống ngô địa phương ngày
càng có xu hướng giảm, nhiều giống ngô nếp quý hiếm sẽ bị mất dần. Như
vậy, việc sưu tập và nghiên cứu các giống ngô nếp địa phương góp phần bảo
tồn nguồn gen cây ngô là rất cần thiết.
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức DNA và đặc điểm hóa sinh ở
giai đoạn hạt là cơ sở khoa học để đề xuất việc chọn những giống ngô có năng
suất cao và chất lượng tốt góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây ngô. Từ
đó tuyển chọn giống ngô thích hợp làm vật liệu chọn giống là những vấn đề
rất được quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô
(Zea mays L.)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá chất lượng hạt của một số giống ngô nếp địa phương (Zea mays L.)
- Khảo sát sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô bằng kỹ
thuật
RAPD.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng và kích thước hạt của một số
giống ngô nếp địa phương.
- Xác định hàm lượng lipid, protein, đường trong hạt của các giống ngô
nghiên cứu.
- Phân tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức
sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống ngô nghiên cứu.

Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm. Cây mầm chủ yếu sử
dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phân phía trên hạt phát
triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao


lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá
mầm. Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát
triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ. Ngô là cây có rễ
chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Hệ rễ có ba loại: rễ mầm, rễ đốt và
rễ chân kiềng. Rễ đốt giúp cho cây hút nước và các chất dinh dưỡng. Rễ
chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này
giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào hút nước và thức ăn cho
cây. Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ khác nhau ở mỗi giống.
Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc. Thân
chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần
từ dưới lên.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ n hau. Độ lớn và
số lá ngô dao động từ 6 đến 22 là tùy thuộc vào giống và điều kiện tự
nhiên. Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá và thìa lá.
Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây
ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ
thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ
cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có
khác nhau.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phân chính: vỏ hạt, lớp alơron,
phôi và nội nhũ. Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô. Vỏ hạt bao
bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tùy thuộc vào từng giống, nằm sau lớp vỏ
hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là thành phần chính
70-78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra còn có
protein, lipid, vitamin, khoáng và enzyme để nuôi phôi phát triển. Phôi ngô

Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á
30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61%... Nếu như ở Châu Âu khẩu phần
ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh
(canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi
thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong
phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo.


Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện
nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ
biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức
ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc.
Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp
ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm
lượng dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng
làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu.
Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp,
ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh
kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công
nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ.
Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm lượng ngô xuất khẩu
khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước
xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước
nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [13].
Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì
vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng. Năm 1979 diện tích
trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn,
đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3
triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008).
Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và

Thành phần hoá học của hạt ngô vàng đều cao hơn so với gạo trắng.
Ngoài thành phần tinh bột, protein, lipid, ở ngô còn chứa nhiều loại
vitamin, trong đó vitamin C cao nhất. Về nhiệt lượng của ngô cao hơn gạo


trắng là 10%. Qua đó cho thấy, ngô là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng
tương đối cao (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100g)
Thành phần hóa học
Gạo trắng
Ngô vàng
Tinh bột (g)
65,00
68,20
Protein (g)
8,00
9,60
Lipid (g)
2,50
5,20
Vitamin A (mg)
0
0,03
Vitamin B1 (mg)
0,20
0,28
Vitamin B2 (mg)
0
0,08
Vitamin C (mg)

đầu người tăng, nên nhu cầu thịt, cá, trứng, sữa tăng mạnh, dẫn đến đòi hỏi
lượng ngô dùng cho chăn nuôi tăng. Nhưng thách thức lớn nhất là 80% nhu
cầu ngô thế giới tăng (266 triệu tấn), lại tập trung ở các nước đang phát
triển. Hơn nữa chỉ khoảng 10% sản lượng ngô từ các nước công nghiệp có
thể xuất sang các nước đang phát triển. Vì vậy, các nước đang phát triển
phải tự đáp ứng nhu cầu của mình (IPRI, 2003).
Bảng 1.2. Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020
Vùng

Năm 1977

Năm 2020

% thay đổi

(Triệu tấn)

( Triệu tấn)

Thế giới

586

852

45

Các nước đang phát triển

295


75

118

57

Tây và Bắc Phi

18

28

56

(Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003)
Theo Đại học Tổng hợp Iowa (2006), trong những năm gần đây khi thế
giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngô đã và đang được chế biến
ethanol, thay thế một phần nhiên liệu xăng dầu chạy ô tô tại Mỹ, Braxin,
Trung Quốc,... Riêng ở Mỹ, năm 2002 - 2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô để
chế biến ethanol, năm 2005 - 2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến năm 2012
dùng 190,5 triệu tấn ngô (Oxfarm, 2004). Diện tích, năng suất, sản lượng ngô
giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch tương đối lớn được thể hiện
bảng 1.3


Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2005 – 2007
Khu vực


13,9

46,5

61,3

59,1

69,1

96,1

82,6

Châu Á

43,7

45,0

46,4

38,3

40,7

39,9

167,3 183,3 185,4



(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008)
Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngô giữa các Châu lục có sự
chênh lệch nhau trong đó Châu Á là khu vực có diện tích trồng ngô lớn
nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha đến năm 2007 là 46,4 triệu ha, chiế m
khoảng 31,6% diện tích ngô toàn thế giới. Đứng ở vị trí thứ hai là khu
vực Bắc và Trung M ỹ chiếm khoảng 28% diện tích trồng ngô thế giới.
Châu Âu là khu vực có diện tích trồng ngô thấp, chiếm khoảng 9,5%
diện tích trồng ngô thế giới. Nhìn chung diện tích trồng ngô của các khu
vực trên thế giới biến động giữa các năm không đáng kể, nếu lấy 2007
làm mốc so sánh thì Châu Âu có giảm về mặt diện tích, còn Châu Á cùng
với Bắc và Trung Mỹ thì diện tích tăng. Bắc và Trung Mỹ là khu vực có
năng s uất cao nhất đạt 75,70 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu:
59,10 tạ/ha, và thấp nhất là Châu Á 39,91 tạ/ha (năm 2007). Sở dĩ Châu
Á có năng suất thấp chủ yếu là do khu vực này có điều kiện thời tiết bất
thuận như: hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chưa thuận lợi. Giai đoạn 2005 2007, Châu Á và khu vực Bắc và Trung Mỹ năng suất tăng mạnh, Châu


Á tăng 2,4 tạ/ha, Bắc và Trung Mỹ tăng 9 tạ/ha, đến năm 2007 do nhiều lý do
khác nhau hai khu vực này đều có năng suất giảm. Bắc và Trung Mỹ là khu
vực dẫn đầu về sản lượng ngô trên toàn thế giới, năm 2005 đạt 289,6 triệu tấn,
chiếm 44,45% tổng sản lượng ngô toàn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực
Châu Á đạt 167,3 triệu tấn, chiếm 25,87%% tổng sản lượng ngô toàn thế giới.
Năm
2007 khu vực Bắc và Trung Mỹ đạt 312,0 triệu tấn, chiếm 45,08% tổng sản
lượng ngô toàn thế giới, Khu vực Châu Á đạt 185,43 triệu tấn, chiếm 26,79%
tổng sản lượng ngô toàn thế giới.
Như vậy, trong giai đoạn từ năm 2005 đến 2007 diện tích trồng
ngô trên thế giới tăng không đáng kể, nhưng do áp dụng các thành tựu
khoa học kỹ thuật tiên tiến đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô


30,08

100,64

280,22

Hy lạp

0,84

80,95

6,80

Canada

1,08

77,43

8,39

Trung Quốc

26,22

50,01

131,15

nhanh ở một số nước phát triển và các nước đang phát triển. Hiện nay, thị
trường ngô trên thế giới được đánh giá là một thị trường tương đối khả quan.
Chính vì vậy mà sản xuất ngô trên toàn cầu sẽ tăng trưởng mạnh trong những
năm tới (theo USDA 1/2003).
1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được
trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Là cây lương
thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây trồng chính để phát triển ngành
chăn nuôi. Năng suất ngô ở nước ta trước đây rất thấp so với năng suất ngô


thế giới, do sử dụng giống ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật vào
sản xuất còn hạn chế. Phải tới năm 1991 cây ngô lai mới bắt đầu được đưa
vào sản xuất ở nước ta, tỷ lệ trồng giống lai từ 0,1% năm 1990, năm 2006 đã
tăng lên 80% và đưa Việt Nam trở thành nước sử dụng giống lai nhiều và có
năng suất cao của khu vực Đông Nam Á.
Bảng 1.5. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm
2006
Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(1000 ha)

(Tạ/ha)


Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống
ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như
khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất
khác nhau. Đặc biệt, những năm gần đây do kỹ thuật canh tác, do môi trường,
do sự xuất hiện các giống ngô lai và nhiều nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn
kiệt về nguồn gen giống ngô địa phương. Vì vậy việc sưu tập, nghiên cứu và
đánh giá nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT

1.2.1. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
quan hệ di truyền thực vật


1.2.1.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms –
đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA
hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác
định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen.
Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dò DNA
bổ sung tạo ra từ cùng một locus. RFLP là chỉ thị đồng trội. Ưu điểm của
RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng có thể
xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá
thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các
giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền,
nghiên cứu quan hệ họ hàng. Nhược điểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn
kém và mất thời gian. Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 –
200ng từ mỗi cá thể) [6].
Ignjatovic-Micic D. và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với
kỹ thuật RAPD để xác định quan hệ di truyền của 2178 giống ngô địa
phương. Kết quả xác định khoảng cách di truyền dao động từ 0,1311 đến

để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 dòng ngô lai. Sử dụng kỹ thuật AFLP
thu được 774 băng đa hình, kỹ thuật RAPD khuếch đại được 262 băng DNA,
kỹ thuật RFLP thu được 185 băng và SSR nhận được 68 băng đa hình [30].
Thomas Lübberstedt và cs (2000) đã xác định quan hệ di truyền của một
số giống ngô lai bằng kỹ thuật AFLP với việc sử dụng 8 mồi AFLP thu được
462 băng DNA đa hình [48].
1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn
giản)
Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh). Kỹ
thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR